天南星藥材的鑒別及黃酮含量測定

天南星藥材的鑒別及黃酮含量測定

天南星是一個溫暖、優(yōu)雅、犀利的改良主義。具有潤粘液、祛痰、祛風、止痙攣、結節(jié)和消腫的功效。臨床主要用于治療頑痰咳嗽、口眼歪斜、半身不遂、癲癇等癥,生用外治癰腫及蛇蟲咬傷,被列為有毒中藥。2005年版《中國藥典》(一部)收載品種為天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(wall.)Schott.,異葉天南星A.heterophyllumBl.、東北天南星A.amurenseMaxim.的干燥塊莖。目前,藥典標準尚無鑒別真?zhèn)蔚膶傩岳砘b別方法和控制質量的含量測定方法,也尚未有文獻報道相應的鑒別方法。鑒于有報道其黃酮成分為有效成分,根據(jù)2010年版《中國藥典》修訂工作要求及較普遍鑒別中草藥的有效方法,筆者首次采用薄層色譜(TLC)分析法對天南星進行了鑒別方法的研究,并對其方法的適用性和專屬性進行評價。同時,通過液-質聯(lián)用技術對其成分的分析,結合文獻報道,采用高效液相色譜(HPLC)法對夏佛托苷及異夏佛托苷進行了含量測定方法的研究,發(fā)現(xiàn)文獻報道的色譜條件有弊端。根據(jù)2005年版《中國藥典》有關中藥材質量標準研究指導原則的相關內容,筆者對方法的系統(tǒng)適用性進行了試驗,并驗證分析條件和分析方法,以為天南星藥材的質量標準修訂提供研究基礎和依據(jù)。1合成二氟3-三氟樹脂WatersAlliance2695型HPLC儀,包括Waters2996型PDA檢測器、Empower色譜工作站(美國Waters公司);硅膠G板(青島海洋化工廠分廠);AB-8型大孔吸附樹脂(河北滄州樹脂廠)。乙腈、甲醇均為色譜純,乙醇、乙酸、吡啶、氨水、氫氧化鉀均為分析純;夏佛托苷和異夏佛托苷標準品(筆者自制,純度>98.5%);18批藥材來源有東北、江蘇、安徽、四川,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥植鑒定專家王春根教授、談獻和教授、劉訓紅教授鑒定為天南星的藥典品種。2方法和結果2.1性別標記2.1.1其他tcl證書2.1.2批藥材鑒別用“2.1.1”項下方法,對收集的18批藥材(見表3)進行鑒別。結果,供試品色譜中,在與標準品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。藥材的TLC見圖1。2.2hplc含量測定2.2.1條件12.2.2超聲處理法取藥材粉末(過4號篩)約0.6g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇50mL,密塞,稱重,超聲處理45min,放冷,再稱重,用60%乙醇補足失重,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液25mL,蒸干,用2mL流動相使溶解,離心,取上清液,即得。2.2.3夏佛托苷與異夏佛托苷的標準曲線精密制備含夏佛托苷126.8μg·mL-1和異夏佛托苷63.94μg·mL-1的混合標準品溶液,用二倍稀釋法配制溶液,依次取10μL進樣分析。以對照品的進樣濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標,峰面積積分值(Y)為縱坐標,制備標準曲線,分別得夏佛托苷和異夏佛托苷的回歸方程為:Y=18482X+5846、Y=17222X-2193;相關系數(shù)分別為0.9999和0.9997。結果,二者進樣濃度分別在7.925~126.8μg·mL-1和3.996~63.94μg·mL-1范圍內與各自的峰面積積分值呈良好線性關系。2.2.4計算峰峰面積精密吸取濃度居中的混合標準品溶液10μL,連續(xù)進樣6次,計算對應的色譜峰峰面積。結果,夏佛托苷和異夏佛托苷的RSD分別為1.23%、2.41%,表明儀器精密度良好。2.2.5測定含量的測定同時取同一藥材粉末(過4號篩)6份進行重復性試驗,以建立的方法進行含量測定。結果,夏佛托苷和異夏佛托苷的平均含量分別為0.0220%、0.0117%;RSD分別為2.52%、1.97%,表明方法重復性良好。2.2.6供試品溶液穩(wěn)定性測定以同一供試品溶液在24h內每隔4h依次進行測定。結果顯示,供試品溶液在制備后24h內色譜峰面積無顯著性變化,夏佛托苷和異夏佛托苷峰面積的RSD分別為0.75%、2.24%,表明供試品溶液穩(wěn)定。2.2.7加標回收率的測定取已知準確含量的樣品粉末9份,每份0.3g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別加入一定量的夏佛托苷和異夏佛托苷標準品,以建立的方法進行測定,計算其回收率,結果分別見表1、表2。2.2.8方法適用性試驗按已建方法測定18批樣品,結果見表3。由表3可見,方法適用性強;對不同產地的藥典品種測定結果顯示,被測組分與相鄰的色譜峰都能達到基線分離。3討論3.1黃酮類化合物形成酶的檢測結果試驗表明,因藥材中鑒別對象含量較低,藥材中又有大量的糖類成分,提取濃縮后雜質量大,點板后不易展開,通過純化試驗方法,以AB-8型大孔吸附樹脂處理后能達到要求。根據(jù)文獻資料試用氯仿-甲醇-醋酸系統(tǒng)、甲醇/乙醇-水-吡啶系統(tǒng)等,結果以乙醇-吡啶-氨水-水(4∶1.5∶1.5∶1)為展開劑分離本品鑒別成分最好。在方法研究過程中發(fā)現(xiàn),應用黃酮慣用的顯色劑——1%AlCl3乙醇溶液,未使斑點有顯著的顏色變化,根據(jù)黃酮類化合物在堿性介質中會發(fā)生顏色變化以及對本品中夏佛托苷和異夏佛托苷的結構分析,采用5%氫氧化鉀甲醇溶液作為顯色劑,結果使顯色效果明顯,日光下斑點顯亮黃色,紫外光燈(365nm)下可檢視暗斑。通過考察,結果顯示該方法具有較好的適用性,并能快速、有效地鑒別藥典天南星及其混淆品虎掌南星(見圖3),虎掌南星的供試品溶液在與標準品色譜相應的位置上未顯示相同顏色的斑點。3.2hplc含量測定的建立3.2.1關于有機碳的分離比,實驗結果確定了s18填料中有助于分離的填料在試驗過程中發(fā)現(xiàn),在文獻報道的色譜條件下分析,對夏佛托苷的分離有影響。隨后試驗了20多根色譜柱,考慮了品牌、長度的因素,結果顯示,含碳量較高和較低的C18填料均不適合分離本品成分群。以乙腈-1%醋酸為流動相試驗,結果見圖4。3.2.2流動相、標準品溶液的配制分別試驗了乙腈和甲醇體系流動相的色譜行為,結果顯示乙腈體系對夏佛托苷選擇性差,甲醇體系對異夏佛托苷選擇性差,于是采用甲醇-乙腈流動相體系,通過調整甲醇與乙腈的比例,使兩被測對象均能在合理的保留時間下達到一定的分離度。經(jīng)試驗考察,流動相體系中加入醋酸、磷酸和甲酸均可改善各峰的拖尾現(xiàn)象,通過條件優(yōu)化,以[甲醇∶乙腈(6∶7)]-1%醋酸(13∶87)為流動相,被測組分均可達基線分離。取藥材粉末5g,加60%乙醇50mL,超聲處理45min,濾過,濾液揮盡乙醇,通過AB-8型大孔吸附樹脂柱(內徑1cm,長10cm),收集30%乙醇洗脫液,蒸干,殘渣加乙醇1mL溶解,離心,上清液作為供試品溶液;另分別取夏佛托苷和異夏佛托苷標準品,制成1mg·mL-1的乙醇溶液,作為標準品溶液。照TLC法(2005年版《中國藥典》(一部)附錄ⅥB)試驗,吸取供試品溶液和標準品溶液各5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙醇-吡啶-氨水-水(4∶1.5∶1.5∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%氫氧化鉀甲醇溶液,在日光或紫外光燈(365nm)下檢視。色譜柱:LichrospherC18(150mm×4.6mm,5μm);流