青藏高原青藏高原旱趾旱趾遺傳多態(tài)性研究

青藏高原青藏高原旱趾旱趾遺傳多態(tài)性研究

干旱的物種屬于母乳綱、蠕蟲、老鼠和干旱的動物。世界上確定了14種干旱動物，其中四種分布在中國。喜馬拉雅干旱鼠、西伯利亞干旱鼠、灰干鼠和尾干旱鼠。喜馬拉雅旱獺是我國分布最廣、數(shù)量最多的旱獺種類,主要棲息在海拔2800～4000m的青藏高原。青藏高原特殊的地理環(huán)境造就出喜馬拉雅旱獺獨(dú)特的生物學(xué)特性。喜馬拉雅旱獺作為青藏高原主要的生態(tài)動物之一,因耗氧量低,可用于高原生理、低氧環(huán)境下動物生理及人類高山病病理生理學(xué)的研究。此外,旱獺也被廣泛應(yīng)用在人類乙型肝炎病毒感染、冬眠、動物生態(tài)系統(tǒng)維持、進(jìn)化等方面的研究。筆者以前的研究表明,喜馬拉雅旱獺可自然感染旱獺肝炎病毒(woodchuckhepatitisvirus,WHV),某些地區(qū)的喜馬拉雅旱獺對WHV更是高度敏感,可用于人類乙型肝炎和丁型肝炎的研究;與此同時(shí),筆者也發(fā)現(xiàn)喜馬拉雅旱獺攜帶脂蛋白,能夠抵抗高膽固醇飼料誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化,它可被用于人類心血管疾病的研究。為了更好地確定不同地區(qū)喜馬拉雅旱獺的遺傳結(jié)構(gòu),筆者利用13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(microsatelliteloci)對青海省同仁縣、烏蘭縣和玉樹縣等3個(gè)喜馬拉雅旱獺地理種群的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了檢測。微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)具有分布廣泛、多態(tài)信息含量高、檢測方便等特點(diǎn),是研究物種遺傳多態(tài)性的重要工具,同時(shí)也被應(yīng)用于旱獺的遺傳結(jié)構(gòu)的研究。本試驗(yàn)的初步研究結(jié)果表明,同仁、烏蘭和玉樹這三個(gè)區(qū)域的喜馬拉雅旱獺種群存在高度的遺傳多態(tài)性,且3個(gè)種群之間存在明顯的遺傳差異。該研究結(jié)果為人們了解青藏高原地區(qū)野生喜馬拉雅旱獺的遺傳資源以及利用旱獺模型進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究提供了重要的信息。1材料和方法1.1研究對象的選取在2009-2010年間,筆者選取青海省3個(gè)地理種群的99份喜馬拉雅旱獺尾部標(biāo)本(包括毛發(fā)、肌肉、骨骼,置于陰涼處晾干)作為試驗(yàn)研究對象,標(biāo)本分別來自青海省同仁縣(E:102°20′,N:35°52′;標(biāo)本數(shù)n=50)、烏蘭縣(E:98°48′,N:36°93′;n=28)和玉樹縣(E:97°02′,N:33°00′,n=21)。1.2pcr擴(kuò)增采用過柱法提取旱獺尾部組織基因組DNA。DNA提取試劑盒(D3096-02)由Omega公司提供(OmegaBio-TekInc.Norcross,GA,USA)。旱獺基因組DNA的提取方法按照試劑盒說明操作:用含蛋白酶K的裂解液處理旱獺尾部標(biāo)本,裂解產(chǎn)物過柱、吸附基因組DNA,再用蛋白洗脫液、去離子水洗脫,可得到純化DNA。PCR反應(yīng)體系:北京天根生化科技有限公司提供的PCRMasterMix(KP201-01)。在本次試驗(yàn)中,筆者選擇了13對針對旱獺微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物分析青海省三個(gè)生態(tài)區(qū)域的喜馬拉雅旱獺種群的遺傳多態(tài)性,其中8對引物序列來源于喜馬拉雅旱獺,其他5對引物序列來源于歐洲旱獺,這13對引物序列見表1。上述引物由大連寶生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系的總體積為25μL:8.5μL去離子水,2μL模板DNA(濃度10ng/μL),2μL引物(正向和反向引物各1μL,濃度均為10μmol/L),12.5μL2×MasterMix(0.1UTaq聚合酶,500μmol/LdNTP,20mmol/LTris-HCl,100mmol/LKCl,3mmol/LMgCl2)。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性10min;94℃變性60s,55℃退火60s,72℃延伸90s,循環(huán)40次;72℃延伸10min。4℃保存。熱循環(huán)儀(EDC-810)由北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司提供。1.3電泳的銀染對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用120g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離,電壓120V,電泳時(shí)間90min,電泳結(jié)束后按照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行銀染。銀染方法如下:把PAGE膠先用冰醋酸固定10min、蒸餾水洗3次后,用硝酸銀染20min、蒸餾水漂洗5s,再用染液(含甲醛、碳酸鈉、硫代硫酸鈉)染色4min,最后用75mL/L冰醋酸終止反應(yīng)。然后照相、分析。1.4遺傳多樣性co-關(guān)于用POPGEN32軟件進(jìn)行種群遺傳分析,統(tǒng)計(jì)整個(gè)群體及各群體的等位基因頻率、等位基因數(shù)(allelenumber)、有效等位基因數(shù)(effectiveallelenumber)、基因多樣性即雜合度(genediversity)、Shannon指數(shù)(shannoninformationindex)等參數(shù),估計(jì)種群的遺傳多樣性。根據(jù)Botstein等報(bào)道的公式計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(polymorphisminformationcontent)。利用等位基因頻率計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離和遺傳相似系數(shù),再聚類分析做出鄰位相連法(neighbor-joiningmethod)和除權(quán)配對法(unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverages)系統(tǒng)發(fā)育樹。2系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建喜馬拉雅旱獺基因組DNA微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳銀染結(jié)果見圖1。13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在3個(gè)喜馬拉雅旱獺群體中共檢測出129個(gè)等位基因,平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)是9.9231,有效等位基因是82.0481,占63.60%。各位點(diǎn)有效等位基因數(shù)范圍為3.5953～8.2139,平均值為6.3102。平均雜合度和Shannon指數(shù)范圍分別為0.7219～0.8783和1.4728～2.2287,平均值為8.2139和0.8783。通過對比研究,筆者發(fā)現(xiàn)玉樹縣喜馬拉雅旱獺的雜合度最低(0.7602),同仁縣種群的雜合度最高(0.8207)。玉樹縣喜馬拉雅旱獺的Shannon指數(shù)最低(1.6467),同仁縣喜馬拉雅旱獺的最高(1.9111)。結(jié)果詳見表1。利用等位基因頻率,筆者計(jì)算了3個(gè)喜馬拉雅旱獺種群之間的遺傳相似系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離。結(jié)果顯示,青海省3個(gè)喜馬拉雅旱獺群體的遺傳相似系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離范圍分別為0.7159～0.8037和0.2186～0.3342。同仁縣與烏蘭縣、同仁縣與玉樹縣、烏蘭縣與玉樹縣之間的遺傳相似系數(shù)分別為0.8037、0.7159、0.7599,標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離分別為0.2186、0.3342、0.2746。利用鄰位相連法和除權(quán)配對法,筆者制作出了喜馬拉雅旱獺3個(gè)種群的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)。從圖2看出,玉樹縣的喜馬拉雅旱獺與同仁縣旱獺、烏蘭縣旱獺的遺傳背景差異較大,而同仁縣旱獺與烏蘭縣旱獺的遺傳背景較為相似。3不同地理種群的遺傳多樣性喜馬拉雅旱獺是青藏高原特有的動物種群。由于青藏高原海拔差異較大,多種特殊地理地貌阻隔,導(dǎo)致不同區(qū)域旱獺的遺傳結(jié)構(gòu)出現(xiàn)差異。為了深入了解青藏高原不同區(qū)域喜馬拉雅旱獺的遺傳背景,分析不同區(qū)域喜馬拉雅旱獺對WHV敏感性差異的原因,筆者利用13對微衛(wèi)星標(biāo)記引物對青海省3個(gè)區(qū)域喜馬拉雅旱獺的遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析。微衛(wèi)星DNA是基因組中短串聯(lián)核苷酸重復(fù)序列,核心序列2～6bp,在真核基因組呈均一性分布,與其他DNA分子標(biāo)記(例如RFLPs、AFLPs以及RAPDs)相比,微衛(wèi)星DNA具有高可變性和共顯性優(yōu)勢。此外,微衛(wèi)星DNA側(cè)翼序列在同一物種中一般都是保守的。因此,可針對微衛(wèi)星側(cè)翼DNA序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增包含微衛(wèi)星序列的DNA片段,用來分析一個(gè)種群的遺傳多態(tài)性。微衛(wèi)星標(biāo)記也被應(yīng)用在旱獺種群的遺傳多態(tài)性研究中,如Goossens等、Silva等利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了高山旱獺(Marmotamarmota)種群的遺傳多態(tài)性;Hanslik等篩選了高山旱獺和地松鼠(Spermophiluscitellus)的微衛(wèi)星位點(diǎn),并分析了其種群的多樣性;Kyle等篩選出灰白旱獺(Martmotacaligata)微衛(wèi)星位點(diǎn)并用這些微衛(wèi)星標(biāo)記對灰白旱獺、地松鼠種群的遺傳結(jié)構(gòu)、交配系統(tǒng)、物種進(jìn)化等進(jìn)行了研究。徐金會等從青藏高原4個(gè)不同區(qū)域(德里、烏蘭、沱沱河和安多)喜馬拉雅旱獺種群中篩選出8個(gè)高度變異的微衛(wèi)星位點(diǎn),分析了喜馬拉雅旱獺的遺傳多樣性。在本研究中,筆者從Silva等進(jìn)行歐洲高山旱獺研究采用的16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),并采用徐金會等研究喜馬拉雅旱獺的8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),共計(jì)13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了PCR擴(kuò)增引物,開展了青海玉樹、同仁、烏蘭3個(gè)區(qū)域喜馬拉雅旱獺微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的研究。評估遺傳多樣性的重要指標(biāo)包括有效等位基因數(shù)、雜合度、Shannon指數(shù)、多態(tài)信息含量等。有效等位基因數(shù)反映各等位基因的相互影響,它代表種群多態(tài)性。雜合度即基因多樣性,代表種群的遺傳變異和一致性程度。雜合度大于0.5說明遺傳多樣性水平較高;否則,遺傳多樣性水平較低。Shannon指數(shù)容易受到選擇突變和遺傳漂變方面影響,Shannon指數(shù)越大,遺傳多樣性就越大,反之遺傳多樣性就越小。多態(tài)信息含量是多態(tài)性片段的一個(gè)指數(shù)?；蛭稽c(diǎn)多態(tài)信息含量大于0.5表明多態(tài)性高,在0.25和0.5之間是中度多態(tài)性,低于0.25為低度多態(tài)性。在本研究中,喜馬拉雅旱獺有效等位基因數(shù)已接近每一個(gè)位點(diǎn)等位基因的數(shù)目,微衛(wèi)星位點(diǎn)呈現(xiàn)良好的遺傳多樣性。與此同時(shí),平均每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)是9.9231,高于一般的種群,所以這3個(gè)地理種群喜馬拉雅旱獺都具有較高的遺傳多態(tài)性,每個(gè)種群平均雜合度均大于0.5。Shannon指數(shù)大于1.3701,說明這3個(gè)地理種群旱獺的遺傳背景比較復(fù)雜,容易受到外部環(huán)境的影響。遺傳距離反映不同種群或物種的差異程度。而遺傳一致性指在不同的種群之間基因結(jié)構(gòu)的相似性。遺傳距離越小,則遺傳一致性越高,表示種群的血緣關(guān)系越近。在本研究中,筆者計(jì)算了3個(gè)喜馬拉雅旱獺種群的遺傳距離和遺傳一致性,而且在此基礎(chǔ)上繪制了3個(gè)旱獺種群的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,青海省3個(gè)喜馬拉雅旱獺群體有明確的遺傳關(guān)系,這3個(gè)旱獺種群分為兩個(gè)分支:烏蘭縣旱獺和同仁縣旱獺為一支;玉樹縣旱獺為另一支。這種種群分布與這3個(gè)縣的地理地貌特點(diǎn)基本一致:烏