蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)與功能

蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)與功能

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物的重要集合，是形成生物的基本成分。蛋白質(zhì)的生物活性是由其特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)決定的,化學(xué)結(jié)構(gòu)不變,而空間結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的喪失的過(guò)程稱為蛋白質(zhì)變性或去折疊?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變才稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。有的情況下化學(xué)結(jié)構(gòu)改變并不影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性,這些修飾成為非必需部分的修飾。但是在大多數(shù)情況下,蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致生物活性(如下降以至完全喪失)的改變。自20世紀(jì)70年代末以來(lái),有關(guān)用合成有機(jī)物進(jìn)行蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的研究報(bào)道越來(lái)越多。蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的目的是用于生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)方面。在生物醫(yī)學(xué)方面,化學(xué)修飾可以降低免疫原性的免疫反應(yīng)性、抑制免疫球蛋白E的產(chǎn)生等;在生物技術(shù)領(lǐng)域,酶經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后能夠在有機(jī)溶劑中高效地發(fā)揮催化作用,并表現(xiàn)出特異的催化性能?；瘜W(xué)修飾是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的一種重要手段,也是定向改造蛋白質(zhì)性質(zhì)的一種有力工具。1經(jīng)典技術(shù)中的蛋白質(zhì)功能研究蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾是一種廣泛使用的研究手段,也是一種比較成熟的經(jīng)典技術(shù),在蛋白質(zhì)特別是酶的結(jié)構(gòu)與功能研究中,曾經(jīng)起到過(guò)十分重要的作用。蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的修飾是通過(guò)選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。1.1烷基化試劑和其它試劑由于巰基具有很強(qiáng)的親核性,巰基基團(tuán)一般是蛋白質(zhì)分子中最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)。烷基化試劑和其它一些鹵代酸和鹵代酰氨是重要的巰基修飾試劑。這種修飾的優(yōu)點(diǎn)是容易做到定量定位修飾,可使修飾蛋白的生物活性全部保留,是人們最先研究的特異性修飾。但隨著定位誘變的迅速發(fā)展,半胱氨酸的側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾有被取代的趨勢(shì)。1.2血紅素的共價(jià)形成機(jī)制非質(zhì)子化的賴氨酸的ε-氨基是蛋白質(zhì)分子中親核反應(yīng)活性很高的基團(tuán)。氨基的烷基化、利用氰酸鹽使氨基甲氨?；侵匾馁嚢彼嵝揎椃椒ā０被幕瘜W(xué)修飾在蛋白質(zhì)序列分析中占了極其重要的地位。應(yīng)用氨基修飾的一個(gè)熱點(diǎn)是血紅素—蛋白質(zhì)縮微模型的制備,以期望弄清楚蛋白鏈?zhǔn)窃鯓诱{(diào)節(jié)血紅素的性質(zhì)而產(chǎn)生如此多的活性。有兩種制備思路,一是將血紅素與多肽配位結(jié)合以形成折疊的、非共價(jià)結(jié)合的自組裝低聚物;一是將血紅素與多肽共價(jià)相連以生成折疊的單體。它們都有一共同特點(diǎn):C2對(duì)稱的二聚體,傾向于形成準(zhǔn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的金屬蛋白。前一種思路設(shè)計(jì)出的是一種叫DF1的小四螺旋蛋白,在它內(nèi)部有一氧合的鐵。如Sakamoto等研究了許多四螺旋束蛋白質(zhì),它們?cè)陔娊赓|(zhì)溶液中自動(dòng)折疊以形成血紅素結(jié)合點(diǎn),以容納一個(gè)His(組氨酸)二配位的血紅素。后一種思路設(shè)計(jì)出的是一種叫微色素(mimochrome)的夾心化合物,即共價(jià)的α-螺旋-血紅素-螺旋的三明治結(jié)構(gòu)的化合物。Roberto等通過(guò)用計(jì)算機(jī)制圖、現(xiàn)代NMR技術(shù)和X光衍射進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析,表明血紅素的兩個(gè)丙酰基與兩條C端和N端都被保護(hù)起來(lái)的多肽鏈上的賴氨酸的側(cè)鏈成鍵(酰胺鍵),中心His與血紅素中的鐵配位,兩個(gè)螺旋反向平行,并都和血紅素平行。這些結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的模型比它們的天然對(duì)應(yīng)體易于研究,對(duì)于搞清楚血紅蛋白等的作用機(jī)理以及結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系很有幫助。1.3羧基衍生物的合成目前應(yīng)用最普遍的標(biāo)準(zhǔn)方法是用水溶性的碳化二亞胺類特定修飾蛋白質(zhì)分子的羧基基團(tuán),產(chǎn)物一般是酯類或酰胺類,它在比較溫和的條件下就可以進(jìn)行。用甲醇的鹽酸溶液也可與羧基發(fā)生酯化反應(yīng)。由于羧基在水溶液中的化學(xué)性質(zhì)使得這類修飾方法很有限。1.4ph值和溶劑的影響另外還有咪唑基、酚和脂肪族羥基和二硫鍵等的化學(xué)修飾。這些修飾反應(yīng)與大多數(shù)有機(jī)反應(yīng)不同的一個(gè)重要的特征是反應(yīng)條件要溫和得多,這是防止蛋白質(zhì)分子變性的一個(gè)必要條件。pH值決定了具有潛在反應(yīng)的能力的基團(tuán)所處的可反應(yīng)和不可反應(yīng)的離子狀態(tài),因此是影響化學(xué)修飾反應(yīng)的最重要的條件。另外也要考慮溫度、溶劑的影響。在20種構(gòu)成蛋白質(zhì)的常見(jiàn)氨基酸中,只有極性的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)才能夠進(jìn)行化學(xué)修飾,并且反應(yīng)試劑的專一性不夠。為了克服這一缺陷,人們開(kāi)始使用親和性標(biāo)記試劑,這些化合物是具有化學(xué)反應(yīng)性的蛋白質(zhì)分子的底物或配體的類似物。由于結(jié)構(gòu)的相似性,它們對(duì)底物或配體的結(jié)合部位具有親和性和飽和性,顯示了高度的位點(diǎn)專一性。2注射胰島素,以及糖尿病胰島素是最簡(jiǎn)單和最廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)之一,也是被研究最多的蛋白質(zhì)。注射胰島素,可以治療糖尿病。將化學(xué)修飾技術(shù)運(yùn)用于胰島素是希望獲得在醫(yī)藥上有用的胰島素衍生物,主要包括長(zhǎng)效胰島素、速效胰島素和口服胰島素,這些衍生物具有良好的應(yīng)用前景和潛在的巨大價(jià)值。2.1關(guān)于b鏈氨端氨基酸化胰島素是由A和B兩條肽鏈構(gòu)成,肽鏈之間靠?jī)蓪?duì)二硫鍵(A7-B7,A20-B19)相連接。隨著對(duì)胰島素結(jié)構(gòu)研究的深入,人們了解了越來(lái)越多鏈段的信息和相應(yīng)的功能。如胰島素B鏈氨端的八肽是胰島素分子的結(jié)構(gòu)易變區(qū),具有較強(qiáng)的柔性和易變性。移去B鏈氨端B1-Phe并不影響胰島素生物活力,但免疫活力顯著下降。不同部位的胰島素化學(xué)修飾物的研究結(jié)果表明,胰島素A鏈N端甘氨酸(Gly)是影響胰島素分子與其受體相互誘導(dǎo)契合作用以及活性作用正常發(fā)揮的重要部位之一。萬(wàn)柱禮等研究去掉A鏈N端Al-Gly以及A鏈N端Al-Gly被不同構(gòu)型的氨基酸取代后的結(jié)構(gòu)特征,為闡明胰島素分子與其受體結(jié)合相互作用的可能機(jī)制提供一些重要的結(jié)構(gòu)信息。他們還研究了B鏈氨端去二肽(B1-2)羧端去五肽(B26-30)胰島素。這些胰島素修飾物的結(jié)構(gòu)信息將為胰島素結(jié)構(gòu)與功能研究提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),對(duì)解釋胰島素與受體分子的結(jié)合相互作用有重要意義。2.2高效胰島素類似物采用定位誘變(即突變)技術(shù)在目標(biāo)基因的預(yù)定位點(diǎn)導(dǎo)入突變,然后在適當(dāng)?shù)妮d體系統(tǒng)—宿主細(xì)胞中表達(dá)經(jīng)過(guò)改變的基團(tuán),可以獲得主鏈結(jié)構(gòu)有特定改變的蛋白質(zhì)分子。為了研究胰島素結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系和改善胰島素的治療學(xué)性質(zhì),人們制備了許多的胰島素類似物,從臨床應(yīng)用角度出發(fā),人們主要研究和發(fā)展速效,長(zhǎng)效和高效胰島素類似物;從基礎(chǔ)理論研究角度出發(fā),與胰島素受體結(jié)合部位相關(guān)的胰島素類似物是研究的熱點(diǎn)。1-5mol/l時(shí)，二聚體或六聚體胰島素在濃度小于10-9mol/L時(shí),主要以單體形式存在;濃度高于10-5mol/L時(shí)則以二聚體或六聚體形式存在。因?yàn)橐葝u素以單體形式與其受體結(jié)合表現(xiàn)其生理功能,因而有人通過(guò)在胰島素二聚體形成面上引入電荷或引入側(cè)鏈有較大空間位阻酌氨基酸殘基阻止胰島素形成二聚體,得到單體速效胰島素。2正電荷及糖質(zhì)分子胰島素一次注射只有3h左右的降血糖效果。利用蛋白質(zhì)工程方法向胰島素分子引入正電荷或消除原有負(fù)電荷以升高其等電點(diǎn)(原為pH4.5),使其進(jìn)入人體組織后迅速形成晶體或無(wú)定形沉淀,緩慢溶解成單體或二聚體進(jìn)入血液,起到長(zhǎng)效的作用。3人胰島素類似物高效胰島素類似物的研究開(kāi)展較早。定位突變[B10Asp]類的胰島素體外活力和受體結(jié)合能力提高2倍~5倍,甚至更高。Marki等合成的[A8His]人胰島素類似物的促葡萄糖氧化能力、脂肪分解作用和與胰島素抗體的結(jié)合能力分別是標(biāo)準(zhǔn)人胰島素的2.46倍、2.99倍和1.96倍。存在的問(wèn)題是,它們的體內(nèi)生物活力和受體結(jié)合能力并不像體外那樣比天然胰島素高許多倍。因此有待繼續(xù)研究。4可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的相互影響通過(guò)比較定位突變的胰島素類似物分別與完整胰島素受體及其可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力可以幫助弄清胰島素受體結(jié)合部位,鑒別出對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性和生物學(xué)功能至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)域或個(gè)別氨基酸殘基,從而獲得有關(guān)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的信息。5胰島素受體的免疫原性試驗(yàn)楊士珍等合成了[A8His,A9Arg,A10Pro,A21Ala]等胰島素類似物,并通過(guò)它們的受體結(jié)合、小白鼠驚厥反應(yīng)和抗體結(jié)合試驗(yàn),試圖說(shuō)明A8-10區(qū)域?qū)σ葝u素受體結(jié)合及免疫原性的影響。Derewenda等人對(duì)B29-Al交聯(lián)胰島素的研究結(jié)果表明,由于B29-Al肽鏈的聯(lián)結(jié)限制了B鏈羧端的運(yùn)動(dòng),導(dǎo)致胰島素失活。其它B鏈羧端的變異胰島素和修飾胰島素的研究工作也都證明,B鏈羧端修飾物在胰島素發(fā)揮生物功能時(shí)的重要性。3修飾蛋白在養(yǎng)刑事學(xué)藥物中的應(yīng)用化學(xué)修飾是一種重要的設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的手段。迄今為止,已有一百多種蛋白質(zhì)被修飾后在臨床應(yīng)用中顯示出優(yōu)良性質(zhì),如:物理和熱穩(wěn)定性增強(qiáng),對(duì)酶降解敏感程度的降低,溶解度的增大,在體內(nèi)循環(huán)半衰期、清除時(shí)間的增長(zhǎng),免疫原性和抗原性的降低及毒性的減小等。修飾蛋白在肽