犬瘟熱診斷技術(shù) 編制說明

1犬瘟熱（Caninedistemper,CD）是由犬瘟熱病毒（Canine2李然棟：青島巴特菲科技發(fā)展有限公司，負責熒光定量RT-PCR3楊珍：青島海華生物集團股份有限公司，負責熒光定量RT-PCR4RT-PCR檢測、病毒分離鑒定、熒光定量RT-PCR檢測等方法進行驗證，熱病毒方面研究頗深。專家就標準的格式排版、主要技術(shù)內(nèi)容細節(jié)、5主要內(nèi)容包括技術(shù)指標、參數(shù)、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規(guī)則等。9OIE發(fā)布的《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》以及《小動物內(nèi)科學》擴增循環(huán)數(shù)，Ct值的大小與所設定的熒光閾值有關，也與初始模板定的線性關系。Ct值越小，則代表所檢樣品的起始濃度量越大。利7Fig1ThefuctionaLmechanismofTaqmanprobe89制備、免疫酶檢測、免疫組織化學檢測、RT-PCR檢測、膠體金試紙Table1.1NGenePrimersandProbeSequencesN-FN-R用公式計算出標準品質(zhì)粒的拷貝數(shù)，重組N基因的質(zhì)?？傞L度為PCR循環(huán)進行篩選，退火溫度選擇從55℃逐漸遞增到60℃,篩選出-2-3-2-3-2-3（配方見下表獲得外周淋巴細胞。6Table1.2Real-timefluorescencequantitativePCRreactionsystemPrimeScriptRTEnzyme3.2結(jié)果與分析Fig1.1RealtimefluorescencequantitativeamplificationcurveFig1.2TaqManfluorescencequantitativePCRamplificationcurvebasedonCDVNFig1.6IntrabatchrepetitionofCDV-NTaqManfluorescentquantitativePCR-2-3-4 Table1.5Batchduplicat質(zhì)粒稀釋倍數(shù)Cq1Cq2Cq3Cq4Cq5Cq6CV(%)-2-3-4Table1.4DetectionofLymphocytesinvitrobyCDV-NTaqManfluorescencequantitativePCRassay12456感染組29.8129.8329.8729.7929.78對照組 96孔ELISA板（美國Costar公司iMark酶標儀（北京元業(yè)伯樂科技包被液：0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液（Na2CO3：1.59g，2PO42HPO4：對實驗室保存的20份陰性血清，按照已確立的ELISA反應條件，檢測OD450nm值，計算出20份血清的OD450nm值的平均值X和標準差SD，根100μL，每份血清做2個重復，向其中一個重復的每管血清中加入450nm計算變/樣品數(shù)[73]。Tab.2.1TheuniformnessofELISAplateABCDEFGHIGKL1234578Tab.2.2Determinationoftheantigencoatingconcentrationandserumdilution+-+-+-+-450nmTab.2.3DeterminationoftheoptimalconditionforcoatingHprotein+ ++450nm Tab.2.4Determinatio Tab.2.5DeterminationofoptimalblockingtimeTab.2.6Determinationofoptimalreactiontimeofsera均值X=0.222和標準差SD=0.056。ELISA陰陽性臨界值等于XTab.2.7ThresholdforindirectELISA3456789經(jīng)抗原阻斷的陽性血清OD450nm值比未經(jīng)Tab.2.8Resultsofblockingtest345Tab.2.9ELISAresultsofintro-batchduplicabilitytest 平均值X123Tab.2.10ELISAresultsofinter-batchduplicabilitytest 平均值X123 Tab.2.11Theresultofs Fig.2.1ThecorrelationofindirectELISAaTab.2.12ThecomparisonofindirectELISA12345ABCDEF免疫學診斷的方法有瓊脂免疫擴散試驗(AGP)、SPA協(xié)同凝集試組化技術(shù)、免疫熒光技術(shù)(IF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法。其中瓊脂免疫擴散試驗(AGP