犬瘟熱診斷技術(shù) 編制說(shuō)明

1犬瘟熱（Caninedistemper,CD）是由犬瘟熱病毒（Canine2李然棟：青島巴特菲科技發(fā)展有限公司，負(fù)責(zé)熒光定量RT-PCR3楊珍：青島海華生物集團(tuán)股份有限公司，負(fù)責(zé)熒光定量RT-PCR4RT-PCR檢測(cè)、病毒分離鑒定、熒光定量RT-PCR檢測(cè)等方法進(jìn)行驗(yàn)證，熱病毒方面研究頗深。專(zhuān)家就標(biāo)準(zhǔn)的格式排版、主要技術(shù)內(nèi)容細(xì)節(jié)、5主要內(nèi)容包括技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則等。9OIE發(fā)布的《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》以及《小動(dòng)物內(nèi)科學(xué)》擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，Ct值的大小與所設(shè)定的熒光閾值有關(guān)，也與初始模板定的線(xiàn)性關(guān)系。Ct值越小，則代表所檢樣品的起始濃度量越大。利7Fig1ThefuctionaLmechanismofTaqmanprobe89制備、免疫酶檢測(cè)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)、RT-PCR檢測(cè)、膠體金試紙Table1.1NGenePrimersandProbeSequencesN-FN-R用公式計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)，重組N基因的質(zhì)?？傞L(zhǎng)度為PCR循環(huán)進(jìn)行篩選，退火溫度選擇從55℃逐漸遞增到60℃,篩選出-2-3-2-3-2-3（配方見(jiàn)下表獲得外周淋巴細(xì)胞。6Table1.2Real-timefluorescencequantitativePCRreactionsystemPrimeScriptRTEnzyme3.2結(jié)果與分析Fig1.1RealtimefluorescencequantitativeamplificationcurveFig1.2TaqManfluorescencequantitativePCRamplificationcurvebasedonCDVNFig1.6IntrabatchrepetitionofCDV-NTaqManfluorescentquantitativePCR-2-3-4 Table1.5Batchduplicat質(zhì)粒稀釋倍數(shù)Cq1Cq2Cq3Cq4Cq5Cq6CV(%)-2-3-4Table1.4DetectionofLymphocytesinvitrobyCDV-NTaqManfluorescencequantitativePCRassay12456感染組29.8129.8329.8729.7929.78對(duì)照組 96孔ELISA板（美國(guó)Costar公司iMark酶標(biāo)儀（北京元業(yè)伯樂(lè)科技包被液：0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液（Na2CO3：1.59g，2PO42HPO4：對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的20份陰性血清，按照已確立的ELISA反應(yīng)條件，檢測(cè)OD450nm值，計(jì)算出20份血清的OD450nm值的平均值X和標(biāo)準(zhǔn)差SD，根100μL，每份血清做2個(gè)重復(fù)，向其中一個(gè)重復(fù)的每管血清中加入450nm計(jì)算變/樣品數(shù)[73]。Tab.2.1TheuniformnessofELISAplateABCDEFGHIGKL1234578Tab.2.2Determinationoftheantigencoatingconcentrationandserumdilution+-+-+-+-450nmTab.2.3DeterminationoftheoptimalconditionforcoatingHprotein+ ++450nm Tab.2.4Determinatio Tab.2.5DeterminationofoptimalblockingtimeTab.2.6Determinationofoptimalreactiontimeofsera均值X=0.222和標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.056。ELISA陰陽(yáng)性臨界值等于XTab.2.7ThresholdforindirectELISA3456789經(jīng)抗原阻斷的陽(yáng)性血清OD450nm值比未經(jīng)Tab.2.8Resultsofblockingtest345Tab.2.9ELISAresultsofintro-batchduplicabilitytest 平均值X123Tab.2.10ELISAresultsofinter-batchduplicabilitytest 平均值X123 Tab.2.11Theresultofs Fig.2.1ThecorrelationofindirectELISAaTab.2.12ThecomparisonofindirectELISA12345ABCDEF免疫學(xué)診斷的方法有瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、SPA協(xié)同凝集試組化技術(shù)、免疫熒光技術(shù)(IF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法。其中瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP