胰島素對小鼠卵巢顆粒細胞體外生長的影響

胰島素對小鼠卵巢顆粒細胞體外生長的影響

卵石是動物繁殖過程中非常重要的細胞。在動物體內(nèi),顆粒細胞的增殖分泌功能與卵母細胞的生長和成熟緊密相關(guān),二者可形成功能上的整體。在體外條件下進行顆粒細胞增殖與分化的研究,可為婦女及雌性動物卵巢功能的檢測、卵巢疾病引起的不孕癥的治療、避孕研究以及動物生殖毒理研究提供新的手段。Channing等第一次證實,在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞發(fā)生了結(jié)構(gòu)和功能的分化。Pescador等報道,豬的顆粒細胞在培養(yǎng)的最初24h內(nèi)附著在培養(yǎng)基質(zhì)上,呈成纖維樣;培養(yǎng)72h時,細胞形狀變?yōu)殇伮肥瘶?。Meidan等在體外將牛的卵巢顆粒細胞和卵泡膜細胞誘導(dǎo)分化為大黃體樣細胞和小黃體樣細胞,并對其形態(tài)和功能進行了鑒定。Kishi等研究了活化素和FSH對大鼠卵巢顆粒細胞分化的影響。但到目前為止,對小鼠卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)的研究很少。本試驗對小鼠卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性以及增殖調(diào)控因素進行了初步研究,以期為進一步闡明卵巢顆粒細胞在體內(nèi)的作用及增殖、分化調(diào)節(jié)機制奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1青生物工程材料劑D/F12培養(yǎng)基,GIBCO公司產(chǎn)品;孕馬血清促性腺激素(PMSG),寧波第二激素廠產(chǎn)品;胎牛血清,購自杭州四季青生物工程材料有限公司;無Ca2+、Mg2+磷酸鹽緩沖液[PBS(-)],中杉金橋公司產(chǎn)品;C-kit免疫組化試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品;青霉素、鏈霉素、兩性霉素-B、促卵泡激素(FSH)、胰島素、重組人表皮生長因子(EGF)、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)、堅固紅和α-萘酚磷酸鹽等均為SIGMA產(chǎn)品。1.1.2試驗動物健康、尚未性成熟的雌性昆明小白鼠,購自第四軍醫(yī)大學(xué),質(zhì)量18～22g。1.2顆粒細胞分離和過濾每只小鼠腹腔注射PMSG(8～10U)48h后,頸椎脫臼處死,無菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢,用PBS(-)清洗3次,在體視顯微鏡下去除其周圍脂肪和被膜,用1mL注射器針頭刺破卵泡使顆粒細胞和卵母細胞釋放出來,加入1g/L透明質(zhì)酸酶消化使顆粒細胞與卵母細胞分離,用孔徑為0.074mm篩網(wǎng)過濾,1000r/min離心5min。棄上清,用PBS(-)清洗3次,加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液(D/F12培養(yǎng)基+100U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素+0.5μg/mL兩性霉素-B+體積分數(shù)10%FBS)重懸。1.3輸注胰島素、fsh、egf對k-gf的影響用臺盼藍染色檢測細胞存活率達70%以上時,調(diào)整細胞數(shù),按照1×105mL-1接種,分別添加2μg/mL胰島素、50ng/mLFSH、20ng/mLEGF,于37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。每間隔24h用胰蛋白酶對每組顆粒細胞進行消化計數(shù)。試驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均數(shù)±標準差”表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。1.4卵細胞的識別1.4.1社會學(xué)觀察在倒置相差顯微鏡下觀察顆粒細胞的生長行為和形態(tài)特征。1.4.2pbs-染色吸出培養(yǎng)液,PBS(-)清洗3次,體積分數(shù)4%多聚甲醛室溫固定15min,再用PBS(-)清洗3次,加入AKP染色液(1.2mg/mLα-萘酚磷酸鹽,1mg/mL堅固紅,0.1mol/LTris鹽,調(diào)至pH值為8.4),作用15～30min,PBS(-)再清洗3次,倒置相差顯微鏡下觀察、照相。1.4.3小鼠抗小鼠免疫后抗體變化按照SABC試劑盒說明書進行。培養(yǎng)細胞用體積分數(shù)4%多聚甲醛固定30min,用體積分數(shù)30%H2O2和純甲醇(體積比1∶50)固定30min,蒸餾水洗3次,滴加體積比1∶300稀釋的C-kit兔抗小鼠一抗,37℃作用1h,PBS(-)洗3次,每次2min;滴加生物素化山羊抗兔二抗IgG,37℃孵育20min,PBS(-)洗3次,每次2min;滴加SABC,37℃孵育20min,PBS(-)洗4次,每次5min;DAB顯色30min,蒸餾水洗滌,照相。2結(jié)果與分析2.1egf和fsh對顆粒細胞增殖的作用由表1可見,在細胞培養(yǎng)的第4天,與對照組相比,添加EGF或FSH對顆粒細胞具有顯著的促增殖的作用(P<0.05),而胰島素促顆粒細胞增殖的作用不顯著(P>0.05)。2.2顆粒細胞的培養(yǎng)倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果表明,剛接種時顆粒細胞呈球形,10h后貼壁生長,培養(yǎng)24h后,形態(tài)不規(guī)則,呈多角形或梭形(圖1-A)。培養(yǎng)5d時可鋪滿皿底,形成單層的顆粒細胞(圖1-B)。部分顆粒細胞還出現(xiàn)聚集生長的特征,形成胚胎干細胞樣集落(圖1-C)。2.3小鼠卵巢份粒細胞集落akp染色和c-傳統(tǒng)免疫組化染色,小鼠卵巢顆粒細胞集落akp染色,小鼠卵巢份由圖2,3可見,與對照(圖2-A、圖3-A)不同,小鼠卵巢顆粒細胞集落AKP染色(圖2-B)和C-kit免疫組化染色(圖3-B)均為陽性。3討論3.1胰島素對人工林各組織的增殖和分化的作用FSH是卵巢顆粒細胞生長增殖與分化的決定因素,FSH受體主要存在于小鼠的卵巢顆粒細胞上,因此,FSH對其自身受體既有上調(diào)節(jié)作用,又有下調(diào)節(jié)作用。高慶華等研究認為,在生理濃度范圍內(nèi),FSH濃度越高,對顆粒細胞增生作用的刺激越強。還有研究證實,牛卵巢顆粒細胞的體外培養(yǎng)對FSH有劑量依賴性。本試驗結(jié)果表明,添加50ng/mLFSH,在培養(yǎng)的第4天其對卵巢顆粒細胞表現(xiàn)出明顯的促增殖作用(P<0.05)。EGF能刺激體內(nèi)或體外培養(yǎng)的多種組織和細胞的增殖或分化。據(jù)李芳等報道,EGF的結(jié)合位點位于次級和三級卵泡的顆粒細胞上,卵丘顆粒細胞與EGF的結(jié)合能力較卵泡壁上的顆粒細胞強,而閉鎖卵泡的顆粒細胞與EGF的結(jié)合能力弱或沒有結(jié)合能力。本試驗發(fā)現(xiàn),EGF組與對照組相比在培養(yǎng)的第4天也表現(xiàn)出明顯的增殖效應(yīng)(P<0.05),說明本試驗培養(yǎng)的小鼠顆粒細胞中可能存在較大比例的卵丘顆粒細胞。胰島素可促進葡萄糖代謝及RNA、蛋白質(zhì)和磷脂的合成。胰島素對細胞的作用是多方面的,其可能的機制之一是通過與胰島素樣生長因子-I(IGF-I)受體結(jié)合促進細胞代謝。眾所周知,細胞的生長增殖與分化是完全向兩個相反方向發(fā)生的,即相互頡頏。在大鼠和豬的報道中,添加胰島素有增加顆粒細胞孕酮產(chǎn)量的作用。正常卵巢顆粒細胞不會增加孕酮產(chǎn)量,只有發(fā)生分化的卵巢顆粒細胞才會導(dǎo)致孕酮量的增加。高慶華等報道,胰島素刺激顆粒細胞分化成黃體細胞并呈現(xiàn)出劑量依賴模式。本試驗結(jié)果顯示,2μg/mL胰島素對小鼠卵巢顆粒細胞沒有顯著的促增殖作用(P>0.05),這可能是胰島素促進顆粒細胞分化所致。3.2細胞生物學(xué)檢測本研究首次發(fā)現(xiàn),部分小鼠卵巢顆粒細胞具有聚集生長特性,能形成胚胎干細胞樣集落,這與Gutierrez等體外培養(yǎng)的牛卵泡顆粒細胞的生長特性相似。為了進一步驗證顆粒細胞集落是否具有干細胞表面特異性標記,作者特此選擇了AKP染色和C-kit免疫組化染色對細胞進行了鑒定,結(jié)果顯示兩者均呈陽性,表明此類細胞可能具有干細胞特性。Tina等在1999年提出牛卵巢顆粒干細胞的假說。張靜等發(fā)現(xiàn),在大鼠排卵前期卵泡顆粒細胞中有端粒酶的表達,這提示大鼠卵巢顆粒細胞中也可能存在干細胞群