一株腸-水兩相流降解垃圾中微生物的細菌一株絲狀真菌的鑒定及其對四類有機物降解能力的研究

一株腸-水兩相流降解垃圾中微生物的細菌一株絲狀真菌的鑒定及其對四類有機物降解能力的研究

隨著我國城市化進程的加快，人口的持續(xù)增長和高密度腐敗的集中，剩余垃圾的數(shù)量每天都在增加。雖然一家一戶的廚余垃圾數(shù)量并不多,但千家萬戶匯集的總量卻相當龐大,其來源分散不易收集,難以進行堆肥或飼料加工等資源化利用,同時其有機質(zhì)含量高,水分大極易腐爛發(fā)臭,對垃圾填埋或焚燒處置帶來諸多難題。因此研發(fā)家庭廚余垃圾的微生物降解原位消除技術(shù),實現(xiàn)就地產(chǎn)生就地消納,是解決城鎮(zhèn)居民生活有機垃圾造成嚴重環(huán)境污染問題的良好途徑。廚余垃圾是居民在生活消費過程中形成的一種生活廢物,其化學組成上,主要包括淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、脂類。篩選獲得對這四類大分子有機物具有高效降解能力的微生物菌株對廚余垃圾的微生物降解原位消除技術(shù)至關(guān)重要。為此,本研究對先期工作中分離獲得的一株絲狀真菌進行了分類學鑒定并對其淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、脂類降解能力進行了檢測。1材料和方法1.1試驗中的蘑菇采用真菌選擇性培養(yǎng)基從有機肥中分離、純化獲得一株絲狀真菌,并保藏于本實驗室,代號為No.1。1.2四種類型的有機物質(zhì)的分解能力1.2.1培養(yǎng)基的制備取對數(shù)生長期No.1菌液點接于蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、纖維素培養(yǎng)基平板,觀察蛋白質(zhì)降解圈或菌落直徑隨時間的變化。四類大分子有機物培養(yǎng)基配方如下:蛋白質(zhì)培養(yǎng)基:脫脂奶粉50g/L,可溶性淀粉10g/L,酵母膏5g/L,KH2PO41g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,瓊脂20g/L,pH7.0~7.2。脂肪培養(yǎng)基:(NH4)2SO42g/L,K2HPO41g/L,KCl0.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,FeSO40.01g/L,瓊脂20g/L,pH自然,橄欖油乳化液12mL(橄欖油:20g/L聚乙烯醇(PVA)為1∶3,轉(zhuǎn)速1000r/min,5min),加溴甲酚紫。纖維素培養(yǎng)基:K2HPO40.50g/L,MgSO40.25g/L,CMC-Na1.88g/L,剛果紅0.20g/L,瓊脂16.00g/L,明膠2.00g/L,pH7.0。淀粉培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,可溶性淀粉2g/L,牛肉膏5g/L,NaCl5g/L,瓊脂20g/L,pH7.0~7.2。上述培養(yǎng)基均在121℃下滅菌20min,倒平板,備用。1.2.2膜蛋白的酶催化作用(1)蛋白酶活性測定種子培養(yǎng)液:K2HPO47.0g/L,KH2PO42.0g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,干酪素4.0g/L,酵母膏6.0g/L,NaCl0.5g/L,甘油7.0g/L,CaCl20.067g/L,pH7.0,121℃滅菌20min。蛋白酶活力單位定義為:酪蛋白在酶催化下每min水解得到1μg酪氨酸時所需酶量。(2)淀粉酶活性測定種子培養(yǎng)液:淀粉10g/L,蛋白胨5g/L,K2HPO42g/L,NaCl1g/L,CaCl20.1g/L,MgSO4·7H2O0.1g/L,121℃滅菌20min。淀粉酶活力單位定義為:淀粉在酶催化下每min水解形成1μg還原糖時所需酶量。(3)脂肪酶活性測定種子培養(yǎng)液:NaNO32g/L,MgSO4·7H2O0.3g/L,NaCl10g/L,橄欖油20g/L,CaCl20.3g/L,NH4Cl0.3g/L,121℃滅菌20min。脂肪酶活力單位定義為:脂肪在酶催化下每min水解形成1μmol脂肪酸時所需酶量。(4)纖維素酶活性(CMCase)測定種子培養(yǎng)液:牛肉膏1.5g/L,蛋白胨1.0g/L,CaCO32.0g/L。分裝于試管至7cm深層,并放入1cm×6cm濾紙條1條,121℃滅菌20min。纖維素酶活力單位定義為:纖維素在酶催化下每min水解形成1μg葡萄糖時所需酶量。1.3分類評價1.3.1社會學觀察采用顯微鏡(Nikon,EclipseE600)對菌株No.1進行形態(tài)觀察。1.3.2血液檢測將菌液滴于血平板上,在30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.1.3.3pcr擴增引物DNA提取方法刮取少量真菌菌絲,加10mMTris-HCl緩沖液20μL,80℃水浴30min,然后冰浴5min,4℃12000r/min離心5min。取上清液作為模板DNA直接用于PCR擴增。18SrDNA的PCR擴增用于18SrDNA的PCR反應的引物為一對通用引物。正向引物ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′,反向引物ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應體系(20μL)為:10×PCRbuffer2μL、dNTP(2mmol/L)2μL、MgCl2(25mmol/L)1.6μL、正、反向引物(5mmol/L)各2μL、Taq酶(5U/μL)0.2μL、模版DNA1μL、雙蒸水補足至20μL。PCR程序如下:94℃預變性5min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,進行35個循環(huán),最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物的純化和測序由上海英駿生物技術(shù)有限責任公司完成。1.3.4系統(tǒng)繁殖的分析2結(jié)果與分析2.1菌落直徑的測定菌株No.1在蛋白質(zhì),脂肪、纖維素和淀粉培養(yǎng)基平板上的菌落的直徑變化如圖1所示。接種1d后,No.1在蛋白質(zhì)和淀粉平板上的菌落直徑都超過2cm;3d后在蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪和纖維素平板上的菌落直徑分別達8.7、4.5、3.1和4.2cm。說明該菌株對蛋白質(zhì)具有很強的降解能力,對淀粉、脂肪和纖維素也有較強的降解能力。2.2胞外酶活性測定蛋白質(zhì)、纖維素、淀粉、脂肪等有機大分子物質(zhì)微生物不能直接吸收利用,而是通過分泌到體外的胞外酶的作用將大分子有機物水解轉(zhuǎn)化為簡單的低分子有機物質(zhì),如單糖或氨基酸、有機酸后才能通過微生物細胞膜,供生長代謝或自身物質(zhì)轉(zhuǎn)化之用。因此本研究所測定的酶活都是胞外酶。由表1可見,培養(yǎng)1d后,分別在菌液中檢出了較高的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性,第6天才檢出纖維素酶的活性。上述結(jié)果進一步表明,該菌株對蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪有較強的降解能力,對纖維素也有一定的降解能力,可作為食物垃圾原位降解的候選功能菌株。2.4no.1重組菌株的鑒定如圖2所示,No.1的菌絲無隔膜,氣生菌絲如白色棉絮,無匍匐菌絲及假根。孢囊梗不成束,單生。孢囊梗直接由菌絲伸出,呈分支狀,孢子囊球形。孢子囊破裂后釋出孢子。初步鑒定為毛霉屬(Mucorsp.)的一個種。同時,在血平板上無溶血反應。提取No.1菌株的18SrDNA經(jīng)PCR擴增獲得683bp序列,與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析,并利用數(shù)據(jù)庫重相似的18SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖3所示,No.1同雅致放射毛霉(ActinomucorelegansAY243955)的相似性高達99%。因此,命名菌株No.1為A.elegansNo.1。3觀點4:兩種功能菌的篩選結(jié)果對本實驗室分離、篩選、保藏的一株絲狀真菌No.1,通過形態(tài)觀察和18SrDNA的PCR擴增獲得的683bp序列與GenBank比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析,將其鑒定為雅致放射毛霉(A.elegansNo.1)。同時,根據(jù)對No.1該菌株進行在蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪和纖維素培養(yǎng)基