利用菜籽粕生產(chǎn)菜籽肽的工藝研究

利用菜籽粕生產(chǎn)菜籽肽的工藝研究

植物蛋白及其活性物質(zhì)的研究已成為飼料、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。作為一種高質(zhì)量的植物蛋白資源，如豆籽蛋黃素，如何深入研究和開發(fā)已成為國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的研究重點(diǎn)。目前,國(guó)內(nèi)外研究者已從菜籽蛋白中制取多種活性肽,這些研究將為菜籽蛋白的深入開發(fā)利用提供一條新的途徑。以菜籽粕或菜籽蛋白為原料制備菜籽肽的方法主要有化學(xué)水解法、酶水解法和微生物發(fā)酵法,其中,微生物發(fā)酵法因其不僅能將菜籽蛋白降解成低分子肽,還能提高粗蛋白含量和降解硫甙等抗?fàn)I養(yǎng)因子而具有廣泛的應(yīng)用前景。微生物發(fā)酵過程中,發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分,比如培養(yǎng)基的碳氮比、無機(jī)鹽種類以及含水量等,都會(huì)對(duì)發(fā)酵效果產(chǎn)生一定的影響,因此,選擇合適的培養(yǎng)基,對(duì)最終發(fā)酵效果的好壞尤為重要。為了進(jìn)一步提高菌種的產(chǎn)酶及酶解效率,獲得盡可能高的菜籽肽產(chǎn)量,本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉的混菌組合為出發(fā)菌種,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面分析法,優(yōu)化混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的培養(yǎng)基條件,并擬合二次多項(xiàng)回歸方程,得到混菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配比。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒1.1.2原料和試劑菜籽粕:南京隆盛植物油脂有限公司,粗蛋白質(zhì)含量38.47%,水分11.46%,硫甙含量52.38μmol/g;所用試劑均為分析純。1.1.3培養(yǎng)基的制備枯草芽孢桿菌采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸餾水1000mL,瓊脂20g,pH7.2,121℃滅菌20min,不加瓊脂作液體培養(yǎng)基使用;雅致放射毛霉采用PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯300g,葡萄糖20g,瓊脂15g,蒸餾水1000mL。1.2精密檢測(cè)儀器立式電熱壓力蒸氣滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺(tái):蘇凈集團(tuán)安泰公司;722N紫外-可見分光光度計(jì)、PHS-3C型精密數(shù)顯pH計(jì):上海精密科學(xué)儀器廠;GL-20B型高速冷凍離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠;全溫立式振蕩培養(yǎng)箱:太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;PQX型多段可編程培養(yǎng)箱:寧波東南儀器有限公司;ALpHA2-4型真空冷凍干燥機(jī):德國(guó)CHRIST公司。1.3方法1.3.1菌體濃度的測(cè)定枯草芽孢桿菌經(jīng)斜面活化后刮取2環(huán)接入100mL液體種子培養(yǎng)基中,8層紗布封口后,在37℃、120r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24h。雅致放射毛霉接種于斜面培養(yǎng)基上,于28℃恒溫培養(yǎng)5d。從枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基和雅致放射毛霉斜面培養(yǎng)基中分別取一定量的細(xì)菌和孢子于無菌水中,調(diào)節(jié)菌體濃度為1×107cfu/mL。無菌水中事先加入葡萄糖和KH2PO4(分別以發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn),按添加量添加),調(diào)節(jié)pH值,即可得到發(fā)酵劑。1.3.2固發(fā)酵培養(yǎng)基制備混菌組合中的菌種不分先后,按1:1的接種比例同時(shí)把制備好的菌懸液以1×107cfumL的接種量接入已滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中。調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度30℃、濕度90%,定時(shí)攪拌通氣,3d后取樣測(cè)定。發(fā)酵培養(yǎng)基成分:菜籽粕、麩皮、葡萄糖、KH2PO4、水。1.3.3上清液積的測(cè)定發(fā)酵后的固態(tài)基質(zhì),一部分取樣后加蒸餾水定容至150mL,攪拌30min,2~4℃條件下4000×g離心20min,測(cè)定其上清液體積,用0.45μm微孔濾膜過濾上清液,除去不溶物和細(xì)菌,備用。另一部分取樣后冷凍干燥、粉碎,用于樣品中硫甙含量的測(cè)定。1.3.4指標(biāo)測(cè)定1.3.4.1.細(xì)菌數(shù)量測(cè)定1.3.4.2氮溶解指數(shù)的測(cè)定1.3.4.離子束上nm值取5mL處理液,加入等體積10%的三氯乙酸(TCA),靜置30min,2~4℃條件下,4000×g離心20min,取2mL上清液,加8mL雙縮脲試劑,25℃下靜置30min,測(cè)OD540nm值。肽得率按公式(1)計(jì)算。1.3.4.4-硫酸含量測(cè)定1.3.5培養(yǎng)條件的優(yōu)化1.3.5.混菌培養(yǎng)組成對(duì)混菌發(fā)酵效果的影響在枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽過程中,發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)混菌發(fā)酵效果產(chǎn)生一定的影響,本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,分別以培養(yǎng)基料液比、葡萄糖添加量、KH2PO4添加量和初始pH值為因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),確定最佳的因素水平。1.3.5.基于模型預(yù)測(cè)模型的最佳培養(yǎng)基條件的驗(yàn)證通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定影響混菌發(fā)酵效果的主要因素,再根據(jù)BoxBehnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,利用DesignExpert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理,得出菜籽肽混菌發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基工藝條件,并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的有效性。2結(jié)果與分析2.1麩皮添加量對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響分別向菜籽粕中添加0、5%、10%、15%、20%的麩皮作為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基,培養(yǎng)基料液比為1:1.5,發(fā)酵劑中未加入葡萄糖和KH2PO4,自然pH值,30℃下發(fā)酵3d,考察不同麩皮添加量對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響,結(jié)果見圖1。在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麩皮,不僅可以補(bǔ)充培養(yǎng)基中不足的氮源和碳源,而且能增加基質(zhì)的透氣性,并保持培養(yǎng)基中水分不散失,有利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶發(fā)酵。但麩皮的添加量也不能太高,以保證發(fā)酵基質(zhì)中的粗蛋白質(zhì)含量。由圖1可知,3個(gè)指標(biāo)均隨麩皮添加量的增加呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì),其中肽得率和硫甙降解率變化趨勢(shì)較為明顯,而氮溶解指數(shù)變化趨勢(shì)較為緩慢。當(dāng)麩皮添加量為5%時(shí),發(fā)酵基質(zhì)的氮溶解指數(shù)和硫甙降解率最高,且菜籽肽含量也處于最大值,因此選用菜籽粕中添加5%的麩皮作為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。2.2單因素試驗(yàn)初步優(yōu)化了混合菌發(fā)酵培養(yǎng)基的條件2.2.1養(yǎng)基不同料液比對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響用含5%的麩皮和95%的菜籽粕配制培養(yǎng)基,發(fā)酵劑中加入葡萄糖0.3%、KH2PO40.3%,調(diào)節(jié)初始pH值為6.0,30℃下發(fā)酵3d,考察培養(yǎng)基不同料液比對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響,結(jié)果見圖2。培養(yǎng)基含水量的變化對(duì)微生物的生長(zhǎng)及其代謝能力都產(chǎn)生尤為重要的影響。含水量過低會(huì)造成基質(zhì)膨脹程度低,物料較干燥,微生物難以生長(zhǎng),產(chǎn)酶量降低;含水量過高會(huì)減少基質(zhì)內(nèi)氣體體積和氣體交換,也不利于菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。因此,培養(yǎng)基料液比會(huì)最終影響發(fā)酵效果的好壞。由圖2可知,當(dāng)培養(yǎng)基料液比在1:1.5時(shí),3個(gè)指標(biāo)均達(dá)到峰值,說明該條件下有利于菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶,因此,選取1:1.5作為較佳的培養(yǎng)基料液比。2.2.2葡萄糖添加量對(duì)發(fā)酵的影響用含5%的麩皮和95%的菜籽粕配制培養(yǎng)基,培養(yǎng)基料液比為1:1.5,發(fā)酵劑中加入KH2PO40.3%,調(diào)節(jié)初始pH值為6.0,30℃下發(fā)酵3d,考察培養(yǎng)基中不同葡萄糖添加量對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響,結(jié)果見圖3。葡萄糖是最易被微生物利用的一類碳源,因此本實(shí)驗(yàn)選用葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的主要碳源。由圖3可知,3個(gè)指標(biāo)均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),其中肽得率和氮溶解指數(shù)的變化趨勢(shì)相對(duì)比較同步,都在葡萄糖添加量為0.7%時(shí)達(dá)到最大值,而硫甙降解率在葡萄糖添加量為0.5%時(shí)最高。由此可以看出,實(shí)驗(yàn)中一定添加量的葡萄糖,有利于固態(tài)發(fā)酵環(huán)境下肽得率和硫甙降解率的提高,這是因?yàn)槠咸烟鞘且环N速效碳源,可以在發(fā)酵過程中為菌體提供大量碳源,以維持其持續(xù)生長(zhǎng)勢(shì)頭,從而能夠產(chǎn)生大量的酶來降解菜籽粕中的菜籽蛋白和硫甙;但是過高的葡萄糖添加量反而會(huì)降低多肽產(chǎn)量及硫甙降解率,其原因是發(fā)酵過程中葡萄糖過多會(huì)過分加速菌體的呼吸作用,以致培養(yǎng)基中的溶解氧不足,從而使微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶受到抑制。綜合考慮較佳的葡萄糖添加量為0.7%。2.2.3kh2po4添加量對(duì)混菌發(fā)酵指標(biāo)的影響用含5%的麩皮和95%的菜籽粕配制培養(yǎng)基,培養(yǎng)基料液比為1:1.5,發(fā)酵劑中加入葡萄糖0.7%,調(diào)節(jié)初始pH值為6.0,30℃下發(fā)酵3d,考察培養(yǎng)基中不同KH2PO4添加量對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響,結(jié)果見圖4。KH2PO4作為微生物培養(yǎng)基中常用的無機(jī)鹽,不僅可以提供微生物生長(zhǎng)所需的礦物元素,還可以穩(wěn)定培養(yǎng)基的pH值。但是,KH2PO4添加量過高也會(huì)使菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶受到抑制。由圖4可知,混菌發(fā)酵過程中,無機(jī)鹽添加量對(duì)肽得率、氮溶解指數(shù)及硫甙降解率都產(chǎn)生了一定的影響。3個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)都是先升后降的趨勢(shì),且相對(duì)比較同步,雖有一定的區(qū)分度,但差別并不大。當(dāng)KH2PO4添加量達(dá)到0.3%時(shí),肽得率達(dá)到最大值6.30%,同時(shí),另外2個(gè)指標(biāo)氮溶解指數(shù)和硫甙降解率也分別達(dá)到最大值,再增加KH2PO4添加量,將抑制微生物的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶,各發(fā)酵指標(biāo)均有一定幅度的下降。綜合考慮發(fā)酵較佳的KH2PO4添加量為0.3%。2.2.4初始ph值對(duì)枯草芽孢桿菌酶促進(jìn)劑作用效果的影響用含5%的麩皮和95%的菜籽粕配制培養(yǎng)基,培養(yǎng)基料液比為1:1.5,發(fā)酵劑中加入葡萄糖0.7%、KH2PO40.3%,30℃下發(fā)酵3d,考察培養(yǎng)基不同初始pH值對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響,結(jié)果見圖5。由圖5可知,發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)微生物的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶以及酶的作用效果產(chǎn)生一定的影響。在pH6~10范圍內(nèi),肽得率和氮溶解指數(shù)呈現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì),但與其他影響因素相比,變化都不明顯,其中肽得率極差為0.24%,出現(xiàn)這種變化趨勢(shì)的原因可能是2種菌所產(chǎn)酶的性質(zhì)不同,本實(shí)驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶,而雅致放射毛霉所產(chǎn)蛋白酶可能為堿性蛋白酶。另外,硫甙降解率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),在pH7.0時(shí)硫甙降解效果最好,說明中性條件比較適宜這兩種菌產(chǎn)生相應(yīng)的芥子酶系。但是,當(dāng)pH>7時(shí)滅菌容易導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)液中的葡萄糖發(fā)生糖焦化反應(yīng),且已知本實(shí)驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶,因此,考慮到后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中的易操作性,選取pH6.5作為發(fā)酵的初始pH條件。2.3反應(yīng)分析對(duì)混合菌發(fā)酵培養(yǎng)基的條件進(jìn)行了優(yōu)化2.3.1響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取了對(duì)枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌發(fā)酵培養(yǎng)基影響較大的3個(gè)因素,即料液比、葡萄糖添加量和KH2PO4添加量,分別將其標(biāo)記為自變量X1、X2和X3,每一個(gè)自變量按低、中、高3個(gè)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼,并以發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率為響應(yīng)值,標(biāo)記為變量Y。采用BoxBehnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。各因素及水平編碼如表1所示。為了最優(yōu)擬合二次多項(xiàng)回歸方程各項(xiàng)系數(shù),依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求,對(duì)影響菜籽肽得率的發(fā)酵培養(yǎng)基關(guān)鍵內(nèi)在因素進(jìn)行了15組實(shí)驗(yàn),其中12組析因?qū)嶒?yàn)、3組中心實(shí)驗(yàn),用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。2.3.2模型擬合與顯著性分析利用DesignExpert軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng),可得料液比、葡萄糖添加量及KH2PO4添加量與菜籽肽得率間的二次多項(xiàng)回歸方程:式中:Y為菜籽肽得率;X1、X2、X3分別代表料液比、葡萄糖添加量和KH2PO4添加量。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3和表4。對(duì)二次多項(xiàng)式擬合模型進(jìn)行方差分析表明(見表3),本實(shí)驗(yàn)所選用模型具有高度的顯著性(P=0.0022<0.01),失擬項(xiàng)在a=0.05水平上不顯著(P=0.2388>0.05),說明模型的擬合檢驗(yàn)顯著;Y的變異系數(shù)CV較低(CV=3.70%),說明實(shí)驗(yàn)操作可信;模型校正決定系數(shù)為0.9232,存在顯著性差異,表明該模型擬合優(yōu)度良好,預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有較好的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)R2=0.9726),發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率約有8%的總變異度不能由該模型解釋,所以此模型可應(yīng)用于菜籽肽發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。由多元回歸方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表4可知,在α=0.01水平上,因素X1對(duì)菜籽肽得率的線性效應(yīng)高度顯著,因素X12對(duì)其曲面效應(yīng)高度顯著,說明培養(yǎng)基料液比對(duì)菜籽肽得率的影響高度顯著;在α=0.05水平上,因素X2、X3對(duì)菜籽肽得率的線性效應(yīng)顯著,因素X32對(duì)其曲面效應(yīng)顯著,因素X1X3的交互作用顯著,說明培養(yǎng)基中KH2PO4添加量對(duì)菜籽肽得率有顯著性影響,培養(yǎng)基料液比與KH2PO4添加量之間的交互作用亦能對(duì)菜籽肽得率造成顯著性影響,而葡萄糖添加量對(duì)菜籽肽得率的線性影響顯著。通過顯著性檢驗(yàn)可以看出,各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)菜籽肽得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),混菌發(fā)酵過程中培養(yǎng)基料液比對(duì)菜籽肽得率的影響最大,KH2PO4添加量的影響次之,葡萄糖添加量的影響最小。2.3.3kh2po4最佳條件組合的確定通過多元回歸方程所作響應(yīng)面圖,可以直觀地反映培養(yǎng)基條件對(duì)菜籽肽得率的影響。圖6顯示了當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖添加量為0.50%時(shí),培養(yǎng)基料液比與KH2PO4添加量對(duì)菜籽肽得率影響交互作用的等高線圖和曲面圖。對(duì)其等高線圖進(jìn)行分析,可以直觀地看出此2因素之間的交互作用顯著,因?yàn)榈雀呔€的形狀反映出2因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小,圓形表示2因素交互作用不顯著,橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。另外,由圖6可知,在本實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi),隨著KH2PO4添加量的增大,肽得率先增大后減小;隨著料液比的增大,肽得率逐漸增大,在料液比為1:1.30附近達(dá)到理論最大點(diǎn)。當(dāng)KH2PO4添加量在0.3%~0.4%、料液比在1:1.20~1:1.45時(shí),菜籽肽得率可達(dá)6.65%以上。為了進(jìn)一步求得各因素的最佳條件組合,對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù),當(dāng)響應(yīng)值Y有最大值時(shí)可求得各因素的水平X1=-0.30、X2=-1.00、X3=0.28,轉(zhuǎn)換后得到最佳培養(yǎng)基條件為:料液比1:1.35、葡萄糖添加量0.50%、KH2PO4添加量0.36%。在此條件下預(yù)測(cè)混菌發(fā)酵后,發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率理論值可達(dá)到6.72%。2.3.4優(yōu)化條件下的菜籽肽得率為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的有效性,根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)和二次多項(xiàng)回歸方程分析結(jié)果,在菜籽肽得率最高時(shí)的培養(yǎng)基條件下,進(jìn)行發(fā)酵重復(fù)實(shí)驗(yàn),此條件下實(shí)際所得菜籽肽得率為6.85%,這與模型預(yù)測(cè)值(6.72%)僅相差+1.93%,非常接近,可見該模型能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)際的發(fā)酵情況,說明響應(yīng)面分析法應(yīng)用于發(fā)酵培養(yǎng)基條件的優(yōu)化是可行有效的。該優(yōu)化條件下所得發(fā)酵產(chǎn)物的菜籽肽得率比優(yōu)化前相對(duì)提高了38.1%,培養(yǎng)基條件優(yōu)化效果較好。另外,在該優(yōu)化條件下測(cè)得實(shí)際的硫甙降解率為62.09%,也要高于優(yōu)化前的60.87%,說明此條件下進(jìn)行混菌發(fā)酵后,菜籽粕中的硫甙得到進(jìn)一步的降解。3最佳培養(yǎng)