小克銀漢霉發(fā)酵產(chǎn)亞麻酸的研究

小克銀漢霉發(fā)酵產(chǎn)亞麻酸的研究

氨基丙烯酸（gla）是人體所必需的脂肪酸，也是人體合成前列腺素和三烯酸的前體。它直接參與了體內(nèi)一系列代謝和生物合成的過程,GLA的代謝異常會(huì)引起某些疾病發(fā)生。人體所需GLA可從食物中亞油酸轉(zhuǎn)化,但轉(zhuǎn)化率有限,足夠的GLA必須從外界獲取。目前,微生物發(fā)酵法獲取GLA是當(dāng)今研究主流,但目前研究的菌種主要集中在深黃被孢霉上,該菌種總脂含量高(50.2%),但總脂中GLA含量少(8.5%);而小克銀漢霉屬菌種總脂含量不高(40%),但總脂中GLA含量很高(>18%),但是目前國內(nèi)外對該菌種的研究工作較少,僅有人對該屬菌種的固態(tài)發(fā)酵和接種情況做了一般性研究,但對于該屬菌種的液體發(fā)酵研究尚未見報(bào)道,本論文就此做了初步研究,旨在尋找一種更適合GLA生產(chǎn)的菌種,為把GLA作為醫(yī)藥產(chǎn)品推向市場奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)菌株雅致小克銀漢霉(Cunningnamellaelegans)C01,本研究組保藏。1.2培養(yǎng)條件和培訓(xùn)1.2.1斜培養(yǎng)基g.l馬鈴薯200,瓊脂15-20,葡萄糖20,98kPa下滅菌15min。1.2.2kh2po45kh2po45葡萄糖60,尿素6,(NH4)2SO45,酵母浸膏3,KH2PO45,MgSO41,生物素0.06mg/L,檸檬酸三鈉4,檸檬酸1,自然pH,裝液量100mL/500mL,78.4kPa下滅菌15min。1.2.3酸3,nh4no33葡萄糖100,MgSO40.3,KH2PO43,酵母浸膏3,檸檬酸三鈉12,檸檬酸3,NH4NO33,微量元素液:Fe(FeSO4)20mg,Ca(CaCl2)20mg,Cu(CuSO4)0.4mg,Zn(ZnSO4)2mg,自然pH,裝液量100mL/500mL,接種量10%,78.4kPa下滅菌15min。1.2.4細(xì)菌激活斜面接種后,經(jīng)28℃培養(yǎng)7d,將斜面培養(yǎng)物放置4℃下冰箱中保存。1.3干重測定發(fā)酵液用綢布過濾,所得濾餅用500mL水徹底清洗,將菌絲體在80℃烘箱中烘24h,干燥皿中冷卻,稱重。1.4子菌懸液取?18×180的斜面一支,刮下孢子加入到滅好菌的大試管內(nèi)(內(nèi)有10顆直徑5mL的小玻璃珠),加入20mL無菌水振蕩10h。1.5ph測量用精密pH試紙測定。1.6總脂測定1.7-亞麻酸法的測定色譜法,色譜條件見文獻(xiàn)。1.8脂肪測定2結(jié)果與討論2.1種子培養(yǎng)條件的確定2.1.1tween-80添加溫度對病原菌生長的影響在不同溫度下,對比表面活性劑Tween-80的加入對菌體生長的影響,結(jié)果見圖1。結(jié)果表明加入Tween-802滴(相當(dāng)于0.2%)有利菌絲體生長,可能是因?yàn)楸砻婊钚詣┑募尤?降低了培養(yǎng)液的表面張力,使菌絲體容易分散,生長微環(huán)境好,菌絲量大;另外,無論有無Tween-80加入,30℃時(shí)菌體生長最好,溫度過高、過低均不利菌體生長。說明該菌體的最適生長溫度為30℃。2.1.2最佳種子培養(yǎng)基配方的確定設(shè)計(jì)不同種子培養(yǎng)基配方,在同一條件下用搖瓶培養(yǎng),獲得最佳種子培養(yǎng)基配方組成見“材料與方法”中所述。固定搖床轉(zhuǎn)速為180r/min,通過改變培養(yǎng)搖瓶封口情況來獲得不同的通風(fēng)量,結(jié)果表明用8層紗布封口菌體生長最好。2.1.3接種方法對菌株生長和氧需量的影響種子培養(yǎng)基中加入0.2%Tween-80,對比不同的接種方法對種子生長影響,結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)表明菌懸液(本實(shí)驗(yàn)暫定菌懸液量為1.0mL)接種生長情況較好,可能是雅致小克銀漢霉作為霉菌,其菌絲較密,而對氧需量又大,只有通過菌懸液接種時(shí),才能使大量菌絲體分散,不致結(jié)團(tuán),從而使菌絲體的生長微環(huán)境情況較好,氧不再是限制性生長因子。2.1.4培養(yǎng)成培養(yǎng)液體培養(yǎng)基時(shí)密度對芽孢桿菌生長的影響顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲體形狀,結(jié)果見圖2。結(jié)果表明48h種齡菌絲粗壯,菌絲頂端開始膨大呈小球狀,可能是在產(chǎn)生孢子,溶液中有少數(shù)散落孢子,接于發(fā)酵搖瓶,培養(yǎng)4d后,所得菌絲干重量最大,為29.424g/L,說明菌絲體移入到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中,孢子發(fā)芽生成新菌絲體,而原有的菌絲也會(huì)繼續(xù)生長。培養(yǎng)24h,時(shí)間太短,菌絲量少;培養(yǎng)72h,時(shí)間太長,菌絲體則部分自溶了。2.2發(fā)酵條件的確定2.2.1小克銀漢霉-亞麻酸發(fā)酵的研究對該菌種在相同培養(yǎng)時(shí)間分別進(jìn)行一級發(fā)酵和二級發(fā)酵,結(jié)果見表2。結(jié)果表明二級發(fā)酵無論干重量還是總脂量(實(shí)驗(yàn)研究表明:菌體內(nèi)γ-亞麻酸占總脂比例只與菌種有關(guān),所以此處以總脂量代替γ-亞麻酸含量作為衡量標(biāo)準(zhǔn))都高于一級發(fā)酵,這是因?yàn)橹臼切】算y漢霉生長到一定程度的積累產(chǎn)物,菌體生長應(yīng)采用較高氮源,較低碳源且在較高溫的條件下;而脂肪酸的骨架需很多的碳原子,故積累脂肪的條件應(yīng)是較高碳源,較低氮源且在較低溫下。兩種不同的目的,要求又不相同,所以二級發(fā)酵法較好。2.2.2反應(yīng)溫度對菌體干重量和總脂量的影響采用不同溫度進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)4d,結(jié)果見圖3。結(jié)果表明25℃時(shí)菌體干重量(DC)和總脂量(TL)均達(dá)最高,分別為23.083和9.551g/L,這可能和酶的最適反應(yīng)溫度有關(guān),偏離這一最適溫度將不利菌體內(nèi)相應(yīng)的酶活性,進(jìn)而影響菌體生長。2.2.3接種量對乳酸菌生長和桿菌生長的影響以48h的種子按不同接種量接入發(fā)酵瓶中,培養(yǎng)4d,結(jié)果見圖4。實(shí)驗(yàn)表明,接種量10%時(shí)最佳,DC和TL分別為24.719、11.400g/L,這是因?yàn)榻臃N量過大時(shí),菌絲互相纏繞,結(jié)團(tuán),菌絲體微環(huán)境惡劣,反而不利菌體產(chǎn)脂;接種量過低,則沒有足夠的生長菌絲體。2.2.4干重量和總脂量在25℃,10%接種量下,觀察不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體生長、生產(chǎn)情況,結(jié)果見圖5。實(shí)驗(yàn)表明,培養(yǎng)7d(168h)后干重量和總脂量均達(dá)最大,依次為35.735、15.980g/L。由圖5可知,該菌種的生長和產(chǎn)物積累是偶聯(lián)型,隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增大,但是有個(gè)最佳培養(yǎng)時(shí)間。2.2.5總脂含量的測定不同初始pH對菌體產(chǎn)油脂的影響見圖6。實(shí)驗(yàn)表明pH值在4.8,5.4時(shí)所得菌體干重量較大分別為23.586、23.721g/L;總脂含量也較高,分別為9.782、和10.195g/L,即pH值在4.8到5.4間是雅致小克銀漢霉最適pH。這是因?yàn)閜H值影響細(xì)胞表面帶電狀態(tài),從而影響菌絲體間聚集狀態(tài),此外,pH還會(huì)影響培養(yǎng)基中有機(jī)化合物的離子化狀態(tài),而多數(shù)非離子狀態(tài)化合物比起離子狀態(tài)化和物更容易滲入細(xì)胞,這樣意味著營養(yǎng)物質(zhì)在不同pH下有不同的進(jìn)入細(xì)胞難度,從而間接影響細(xì)胞生長。2.2.6碳源濃度對碳源質(zhì)構(gòu)的影響,c/n確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n以葡萄糖為碳源、以尿素為氮源,固定氮源濃度,通過改變碳源濃度改變C/N,結(jié)果見圖7。最適C/N為33∶1,即當(dāng)葡萄糖濃度為10%時(shí),菌體干重量和總脂量均達(dá)最大。3tween-80培養(yǎng)模式通過以上實(shí)驗(yàn),確定雅致小克銀漢霉C01菌株適用于二級發(fā)酵,并得到最佳種子和發(fā)酵培養(yǎng)條件。最佳種子培養(yǎng)條件為1%孢子菌懸液接種,加入0.2%Tween-80,并用八層紗布封口,30℃下,180r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)48h。最佳發(fā)酵條件為10%的接種量,加入0.1%的Tween-8