粒細胞巨噬細胞集落刺激因子對乙型肝炎疫苗免疫原性及體液免疫效果的影響

粒細胞巨噬細胞集落刺激因子對乙型肝炎疫苗免疫原性及體液免疫效果的影響

肝炎是一種危及人類健康的系統(tǒng)性問題。中國是乙型肝炎高發(fā)區(qū),有1.2億乙肝病毒攜帶者,占全世界乙肝病毒攜帶者的30%。接種乙肝疫苗是預(yù)防和控制乙肝傳播的重要措施。但是,在接種乙肝疫苗的人群中,存在10%左右的無應(yīng)答或低應(yīng)答者,可能與遺傳因素、免疫系統(tǒng)疾病或其他慢性疾病、年齡、肥胖、煙酒史以及疫苗因素等有關(guān)。因此,研制新型配伍的乙肝疫苗以加強目前的免疫效果尤為必要。粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Gm-csf)是一個具有多項潛能的骨髓造血生長因子,不僅能夠促進造血前體細胞的增殖、分化和成熟,而且可以通過多種機制激活機體的T細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞等,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本文著重探討Gm-csf對乙型肝炎疫苗免疫原性和免疫效果的影響。1生物活性化合物BALB/c小鼠,SPF級,雌性,體重16～18g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證編號SCXK(京)2002-0003)。重組(CHO細胞)乙型肝炎疫苗[RecombinantHepatitisBVaccine(ChineseHamsterOvery),10μg/1.0mL]、注射用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子[RecombinantHumanGranulocyte/MacrophageColony-StimulatingFactorforInjection,rhGm-csf,300μg/支]、CHO細胞表達的基因工程乙型肝炎疫苗原液(HBsAg原液),均由華北制藥集團金坦生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn);乙型肝炎病毒表面抗體酶聯(lián)免疫法診斷試劑盒,北京萬泰生物藥業(yè)有限公司。2方法2.1皮下注射rlph-csf20g將BALB/c小鼠,按體重隨機分為4組,每組8只。①疫苗組:每只小鼠皮下注射乙肝疫苗1μg;②GM+疫苗組:每只小鼠皮下注射乙肝疫苗1μg之前,連續(xù)3d皮下注射rhGm-csf20μg/d;③混合疫苗組:每只小鼠皮下注射乙肝疫苗1μg,同時皮下注射rhGm-csf20μg;④疫苗+GM組:每只小鼠皮下注射乙肝疫苗1μg之后,連續(xù)3d皮下注射rhGm-csf20μg/d;分別于免疫后0,7,14,21,28,35d,由小鼠眼眶后靜脈叢采血約200μL,3000r/min離心15min,分離血清,檢測抗-HBsAg滴度。2.2加強免疫次數(shù)將BALB/c小鼠,按2.1項分組給藥,在初次免疫后14d,同樣免疫方法進行加強免疫1次;期間每隔7d由小鼠眼眶后靜脈叢采血約200μL,3000r/min離心15min,分離血清,檢測抗-HBsAg滴度。2.3小鼠免疫記憶的測定小鼠二次免疫后,待到抗體滴度降低至趨于穩(wěn)定時,用乙肝疫苗原液進行挑戰(zhàn)實驗。因為HBV至今尚不能在實驗室進行離體培養(yǎng),因此,將小鼠皮下注射乙肝疫苗原液1μg/只,考察誘發(fā)的免疫記憶水平。每隔7d由小鼠眼眶后靜脈叢采血約200μL,3000r/min離心15min,分離血清,檢測抗-HBsAg滴度。2.4肝組織的切開術(shù)檢查he染色法待2.3項下的小鼠血清抗體峰值回落,將小鼠處死,做肝組織切片檢查。2.5gewellan?sem小鼠血清抗-HBsAg全抗體滴度計算幾何平均值(GEOMEAN±SEM,n=8);GM+疫苗組、混合疫苗組、疫苗+GM組和疫苗組免疫效果用t檢驗判斷有無顯著性差異。3結(jié)果3.1血清抗體滴度小鼠單次免疫后產(chǎn)生的血清抗-HBsAg應(yīng)答如表1所示。單次免疫后7d,混合疫苗組的血清抗體滴度最高,為疫苗組的7.5倍;直至免疫后35d,混合疫苗組仍為最高,為疫苗組的9.2倍,血清抗體滴度結(jié)果依次為:混合疫苗組>GM+疫苗組>疫苗+GM組>疫苗組。結(jié)果表明:rhGm-csf可以提高小鼠單次免疫的體液免疫水平。3.2各組血清中抗體滴度的比較二次免疫后14d,GM+疫苗組和混合疫苗組血清中抗體滴度迅速升高,高出其他組近2倍(表2),與疫苗組相比有顯著性差異(P<0.05);隨后,GM+疫苗組、混合疫苗組和疫苗+GM組血清中抗體滴度都先后達到峰值,分別為疫苗組的10.0,10.1,8.2倍,且維持較高的水平(表3)。結(jié)果表明:rhGm-csf可以明顯提高二次免疫小鼠體內(nèi)抗體滴度,而且使抗體滴度維持較高的水平,能增強機體體液免疫的效果。3.3小鼠血清中抗體檢測結(jié)果小鼠血清中抗體水平在二次免疫后217d達到穩(wěn)定狀態(tài)。二次免疫后245d用乙肝疫苗原液進行挑戰(zhàn)實驗,21d后,抗體滴度達到較高水平,隨后開始回落;挑戰(zhàn)實驗抗體峰值分別為挑戰(zhàn)前的9.2,5.2,12.8,4.8倍;GM+疫苗組、混合疫苗組和疫苗+GM組血清中抗體分別為疫苗組的1.8,3.1,2.2倍(表3)。結(jié)果表明,實驗小鼠得到獲得性免疫應(yīng)答后,再次感染相同抗原,仍能激發(fā)保護性抗體的產(chǎn)生。這種遠期的保護性免疫主要依賴于免疫記憶的應(yīng)答;并且rhGm-csf可以提高免疫記憶的應(yīng)答水平。3.4肝組織損傷肝組織切片(HE染色),顯示肝細胞正常,未見有肝組織損傷(圖1)。結(jié)果表明:rhGm-csf與乙型肝炎疫苗聯(lián)合免疫,可以提高抗體的產(chǎn)生而不會造成肝組織損傷。4rhp基因?qū)ΛF藥免疫的影響rhGm-csf作用于造血祖細胞,刺激多種免疫細胞的增殖、分化、成熟和功能,增加細胞表面MHC分子、CM和AM的表達,以及促進細胞分泌細胞因子等,形成對小鼠持續(xù)有效的免疫刺激;若再次感染相同病原體,因有免疫保護性存在,多數(shù)感染性疾病可避免。在數(shù)年甚至數(shù)十年的時間,即使體內(nèi)抗體水平降至保護水平以下,宿主仍可不發(fā)生感染。本實驗長期考察了rhGm-csf對基因工程(CHO細胞表達)乙型肝炎疫苗免疫效果的影響。結(jié)果顯示:rhGm-csf可以明顯提高乙型肝炎疫苗的免疫原性,能增強機體體液免疫的效果。特別是在機體的免疫細胞被rhGm-csf激活的同時,接受到乙型肝炎疫苗的抗原刺激,會誘發(fā)更加迅速、有效的抗原提呈,并且在多種細胞因子的協(xié)同作用下,有效的誘發(fā)發(fā)B細胞分化、成熟為抗體分泌型B細胞和記憶型B細胞,使機體對HBV形成了持久有效的