柑桔裂皮病類病毒超低溫脫毒技術(shù)的初步研究

柑桔裂皮病類病毒超低溫脫毒技術(shù)的初步研究曹慶1易干軍2陳金印3丁芳4（1南昌工程學(xué)院科研處，江西南昌330099，2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，廣東廣州510640，3江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西南昌330045，4華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢430070）摘要：本研究以感染柑桔裂皮病的紅江橙、枳殼、香檸檬、紅桔、沙田柚為試驗材料，對柑桔裂皮病類病毒的超低溫脫毒技術(shù)進(jìn)行了研究。初步建立了柑桔組培苗莖尖玻璃化法超低溫體系，而且取得了理想的脫毒效果。結(jié)果顯示：五個品種脫毒率均可達(dá)到88.2%以上。關(guān)鍵詞：柑桔裂皮??；超低溫保存；脫毒StudiesonCitrusExocortisVirioidEliminationbyCryopreservationAbstract:Thisstudyusedinfected‘Hongjiang’sweetorange（CitrusSinensisOsbeck），Poncirus.trifoliata(L.)Raf.，Meyerlemon(CitrusmeyeriY.)，Tangerine(CitrusreticulateBlanco)andShatianpomelo(Citrusgrandis(L.)Osbeck)asmaterial，attemptedtostudytheeliminationofCEVd.Primarilyestablishedthevirus-eliminationtechniqueandthevirus-eliminationratereached88.2%.Keywords：citrusexocortisvirioid；Cryopreservation；virus-elimination中圖分類號：S666柑桔裂皮病是由柑桔裂皮病類病毒（citrusexocortisvirioid,CEVd）引起的[1]。柑桔裂皮病嚴(yán)重阻礙了柑桔的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)，對柑桔產(chǎn)業(yè)已造成嚴(yán)重威脅，種植無病毒苗木是防治柑桔裂皮病的根本措施和重要環(huán)節(jié)[2]。近年來，超低溫脫毒技術(shù)成為一種植物高效率的脫毒方法。其原理是在特殊保護(hù)劑的保護(hù)下，利用-196℃超低溫條件，破壞含有病毒的植物成熟細(xì)胞，而不含病毒的生長點(diǎn)細(xì)胞因為有保護(hù)劑的保護(hù)，可以在一定的條件下恢復(fù)生長，從而達(dá)到大批量快速脫毒的目的。玻璃化法是超低溫保存方法中的一種。玻璃化法以其要求設(shè)備簡單、材料處理步驟簡便、效果和重演性好等優(yōu)點(diǎn)倍受人們推崇[3,4]。本研究采用玻璃化法對柑桔莖尖進(jìn)行超低溫保存脫除柑桔裂皮病類病毒，以期為柑桔材料與方法1.1試驗材料用于試驗的材料為通過嫁接感染柑桔裂皮病的紅江橙（C.SinensisOsbeck）、沙田柚(C.grandis(L.)Osbeck)、紅桔(C.reticulataBlanco)、枳殼(Poncirustrifoliata(L.)Raf)和香檸檬(C.meyeriY.)（毒源來自廣東省楊村）。1.2試驗方法1.2.1莖段培養(yǎng)：取用感染CEVd的柑桔枝條剪成1.5-2.0cm長的莖段，經(jīng)常規(guī)滅菌后，接于添加不同激素的生芽培養(yǎng)基上，紅江橙和沙田柚在添加6-BA0.5mg/L、IBA0.1mg/L、GA30.3mg/L的MT培養(yǎng)基上培養(yǎng)；香檸檬和紅桔在添加6-BA0.25mg/L、NAA0.1mg/L、GA30.3mg/L的MT培養(yǎng)基上培養(yǎng)；枳殼在MT培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度26℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度2000lx條件下進(jìn)行誘芽培養(yǎng)。20d左右繼代一次。1.2.2感病柑桔莖尖玻璃化超低溫處理方法本實(shí)驗以感病香檸檬為材料對柑桔的莖尖玻璃化超低溫處理方法進(jìn)行優(yōu)化研究。選取在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)的20～30d的健康植株，切取長約1cm的芽，在MT+0.7M甘油+40mg/L蔗糖預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，進(jìn)行不同預(yù)培養(yǎng)天數(shù)處理（1、2、3、4、5d）。然后，在無菌條件下，用解剖刀將剝?nèi)∏o尖大小約為2.0～2.5mm，放入1.8mL的冷凍管中。在室溫下浸泡于裝載液（60%PVS2）中裝載，作不同時間處理（0、20、30、40、50min），60%PVS2的成分為：0.15mol/L蔗糖液體培養(yǎng)基與PVS2溶液體積比為40：60，pH調(diào)至5.8，并高溫滅菌。將裝載液移去，在0℃條件下加入PVS2進(jìn)行脫水作不同時間處理（0、40、50、60、70min）。PVS2的成分為：MT培養(yǎng)基+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖，pH調(diào)至5.8，并高溫滅菌。莖尖脫水處理之后，換入一次新鮮的PVS2液，然后將冷凍管裝在金屬套上，套上一根細(xì)線，將材料迅速投入液氮（-196℃）中，在液氮中至少停留1h。將保存材料從液氮中取出，快速投入40℃水浴中解凍90s，用1.2mol/L的蔗糖+MT基本培養(yǎng)基洗滌兩次，每次10min。轉(zhuǎn)到MT+6BA（1.0mg/L）+GSH（10mg/L）的恢復(fù)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)一周，接著轉(zhuǎn)入光下。半個月后統(tǒng)計成活率（莖尖顏色仍為綠色，有部分長芽或長愈傷組織的莖尖占總莖尖數(shù)的百分率），三周后統(tǒng)計植株的再生率（芽萌發(fā)并繼續(xù)生長的莖尖占總莖尖數(shù)的百分率1.2.3超低溫處理后莖尖的嫁接將成活的莖尖進(jìn)行試管嫁接，將成活部位的芽全部用于嫁接。待莖尖嫁接后的材料長出兩片真葉可靠接于大棚中，無毒的大砧木苗上，接后用薄膜袋套上保濕。1.2.4用RT-PCR檢測再生植株的脫毒率。參考文獻(xiàn)[5]的方法。2.結(jié)果與分析2.1柑桔莖尖的超低溫保存2.1.1預(yù)培養(yǎng)對香檸檬超低溫保存結(jié)果的影響當(dāng)預(yù)培養(yǎng)1d時，成活率僅為38.1%，隨著預(yù)培養(yǎng)的時間延長成活率逐漸增加，預(yù)培養(yǎng)3d，成活率最高，達(dá)到57.1%。3d以后成活率又隨之降低，因此，香檸檬最佳預(yù)培養(yǎng)時間為3d。圖1預(yù)培養(yǎng)時間對香檸檬超低溫處理后成活率的影響Fig1EffectofDifferentPrecultureTimeinPrecultureMediumontheSurvivalRateofMeyerlemonafterCryopreservation2.1.2預(yù)處理時間對香檸檬超低溫保存結(jié)果的影響本試驗結(jié)果顯示：預(yù)培養(yǎng)3d后的香檸檬的芽，剝?nèi)∏o尖，室溫下，裝載液（60%PVS2）中預(yù)處理30min效果最好，成活率可達(dá)到87.5%，當(dāng)處理時間延長至50min時，成活率降為69.1%。圖2裝載液（60%PVS2）處理時間對香檸檬超低溫處理后成活率的影響Fig2EffectofDifferentTimeofLoadingwith60%PVS2ontheSurvivalRateofMeyerlemonafterCryopreservation2.1.3PVS取在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后的芽，剝?nèi)∏o尖，室溫下，60%PVS2裝載30min，在0℃下，PVS2處理不同時間，試驗結(jié)果顯示：PVS2處理60min時效果最好，成活率為86.1%。圖3PVS2處理時間對香檸檬超低溫處理后成活率的影響Fig3EffectofDifferentTimeofTreatmentwithPVS2ontheSurvivalRateofMeyerlemonaftercryopreservation綜合以上結(jié)果，香檸檬莖尖超低溫保存較佳體系是：選取初代培養(yǎng)20～30d的莖段培養(yǎng)的芽（約1cm長），在MT+0.7M甘油+40mg/L蔗糖預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d，在無菌條件下，用解剖刀將剝?nèi)〈笮〖s為2.0～2.5mm莖尖。室溫下，60%PVS2裝載30min，然后在0℃下，PVS2處理60min，換一次新鮮的PVS22.1.4其他幾個品種或類型的超低溫保存后的成活率紅江橙、枳殼、沙田柚、紅桔采用優(yōu)化后的超低溫體系保存效果較好。表1其他幾個柑桔品種或類型莖尖超低溫保存后成活率Table1Thesurvivalrateofshoot-tipsbelongingtosomeothercultivarsaftercryopreservation品種或類型莖尖成活率（%）紅江橙88.8±4.17枳殼97.2±4.79沙田柚72.7±2.07紅桔52.3±6.012.2柑桔莖尖玻璃化法超低溫處理后的脫毒率表2柑桔莖尖超低溫保存后脫毒率Table2Thevirus-freerateofshoot-tipsaftercryopreservation品種或類型脫毒率（%）紅江橙94.4枳殼92.5香檸檬88.2沙田柚95.2紅桔89.33.討論目前，柑桔主要是通過莖尖嫁接來獲得無病毒苗木。國內(nèi)外有許多學(xué)者對此進(jìn)行了研究。Navarro等（1975）首次將莖尖嫁接運(yùn)用到柑桔上獲得了無病毒苗木[6]。蔣元暉、趙學(xué)源、宋瑞琳等也報道過莖尖嫁接可以脫除柑橘裂皮病[7-9]。然而，近年來，超低溫脫毒技術(shù)越來越多的應(yīng)用到植物的脫毒上面。因其設(shè)備要求簡單，一個液氮罐就可以處理大量的材料，不占空間，有利于大批材料的脫毒，方便操作且消耗小等特點(diǎn)逐漸被推廣，并有望成為一種植物高效率的脫毒方法。1997年，Brison首次超低溫技術(shù)處理帶李子痘病毒的李離體莖尖，獲得了50％的健康植株[10]。草莓、香蕉、葡萄等果樹上也逐漸報道了用玻璃化法超低溫保存獲得無病毒植株[11-13]。研究表明，超低溫處理的脫毒率與所取莖尖大小無關(guān)，莖尖大小只與超低溫處理后的成活率相關(guān)。經(jīng)超低溫處理后，感染病毒可能性較大的含大液泡和含水豐富的大細(xì)胞則會死亡，而那些幾乎不受病毒侵染的位于莖尖分生組織頂端的幾層細(xì)胞質(zhì)濃度高的小細(xì)胞，則可以經(jīng)液氮處理而存活下來。因此，由這些細(xì)胞再生出的植株可以達(dá)到脫毒的目的。然而莖尖嫁接對莖尖操作要求高，陳如珠等（1991）研究莖尖嫁接脫毒表明，莖尖嫁接所用莖尖大小十分關(guān)鍵，大則影響脫毒率，小則影響成活率[14]。本研究對感染柑桔裂皮病的柑桔莖尖進(jìn)行玻璃化法超低溫保存，采用較大的莖尖（2～2.5mm），就能達(dá)到88.2以上脫毒率，相比莖尖嫁接操作要求更低，且脫毒效果更好。參考文獻(xiàn)：[1]SemancikJS,WeathersLG.Exocortisdisease:evidenceforanewspeciesof“infectious”lowmolecularweightRNAinplants[J].NatureNewBiology,1972,(237):242-244.[2]趙學(xué)源,蔣元暉,周常勇,等.柑桔無病毒良種庫的建立.中國南方果樹[J],1997,26(6),18~21[3]SakaiA,KobayashiS,OiyamaI.Cryopreservationofnucellarcellsofnavelorange(Citrussinensissb.var.brasiliensisTanaka)byvitrification.PlantCellReports,1990,9:30~33[4]王君暉,黃純農(nóng).玻璃化法—園藝作物莖尖和分生組織超低溫保存的新途徑—文獻(xiàn)綜述.園藝學(xué)報[J],1994,21(3):277~282[5]曹慶,易干軍,陳金印,等.柑桔裂皮病類病毒RT-PCR檢測體系優(yōu)化分析,南昌工程學(xué)院學(xué)報[J],2008,27(3),64-66[6]NavarroL,JucurezJ,BallesterJF,etal.Eliminationofsomecitruspathogensproducingpsorosis-likeleafsymptomsbyshoot-tipgraftinginvitro.Proc.8thConfIOCV.IOCVRiverside,1980,162~166[7]蔣元暉，邱拄石，蘇維芳，等.利用莖尖嫁接脫毒培養(yǎng)無裂皮病的臍血橙.植物保護(hù)學(xué)報，1984，10(3)：166[8]趙學(xué)源，蔣元暉.我國柑桔栽培品種的裂皮病鑒定和脫除.園藝學(xué)報，1986，13（2）：91~94[9]宋瑞琳，吳如健，柯沖.莖尖嫁接脫除柑桔主要病原的研究.植物病理學(xué)報,1999，29(3)：275~279[10]BrisonM,BoucaudMT,PierronnetA,etal.Effectofcryopreservationonthesanitarystateofacv.prunusrootstockexperimentallycontaminatedwithPlumPoxPotyvirus.PlantSci[J],1997,123:[11]利用超低溫保存方法脫除香蕉束頂病毒的研究.植物遺傳資源學(xué)