動物dna提取方法的研究進展

動物dna提取方法的研究進展

隨著酶原的發(fā)展，對動物進行了物種識別、物種起源、多樣性、親水性和系統(tǒng)進化的研究是目前動物分子學研究的最有效手段。然而,由于野外取材的局限性,很多材料都必須經過處理后,帶回實驗室進行DNA提取,加大了提取DNA的難度,從而導致進一步實驗的不穩(wěn)定性,造成資源和時間的浪費。因此,總結不同保存條件下提取結構完整DNA方法是很有必要的,本文將近年來諸多動物DNA提取方法進行了比較綜述。1從損傷中提取的材料dna1.1個二價陽離子輔助用乙醇保存動物標本是最常用且最有效的一種方法,王義權等和蔡振媛等曾比較過用含50mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的70%乙醇、70%乙醇保存動物材料的DNA提取,發(fā)現(xiàn)含50mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的70%乙醇材料DNA降解較少。由于大多數(shù)DNA酶需要一個二價陽離子作為輔助因子(如Ca2+、Mg2+等),在70%的乙醇中加入適量EDTA,EDTA可以迅速抑制DNA酶的活性,進一步減少DNA的降解。莫邦輝等在酒精標本DNA模板快速提取中沒有用蛋白酶K,僅在緩沖液(0.5%SDS,10mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,pH8.0),37℃溫浴1h作用下消化材料,也獲得了較好的擴增結果,但本方法僅適用于短片段的PCR擴增。一般經典酒精標本DNA提取方法都會加入蛋白酶K,且在56℃條件下消化8~14h,以達到組織中蛋白質的完全消化。田宗城等認為在提取乙醇保存的組織標本之前,先將標本在蒸餾水中清洗過夜,除去標本中的酒精,減少對蛋白酶K活性的影響,同時在提取過程中將稍微剪碎的尾鰭組織小塊直接放入DNA提取液中,37℃水浴過夜,這樣得到的DNA機械斷裂的機會少,提取液經RNA酶處理,酚、氯仿和異戊醇反復抽提,即可得較純的DNA產物。1.2樣品處理和dna提取在以往的研究中對于福爾馬林標本的DNA提取方法已經有了較大的改進,首先,在預處理標本上,有梯度酒精浸泡和臨界點干燥法。而用梯度酒精預處理標本的方法,使乙醇與標本中的甲醛反應生成半縮醛和縮醛,再通過酒精更換被清除出標本。許黎美等認為將兩種預處理方法結合起來使用,效果更佳。徐來祥等為了防止標本大量吸水造成細胞嚴重破壞,采用PBS溶液(磷酸緩沖液PhosphateBufferSolution)結合乙醇溶液浸泡洗脫樣品,也取得了較好的實驗結果。在DNA提取過程中,周美玉等和杜世章等都用了一種抗氧化劑二硫蘇糖醇(DTT),DTT能有效地抑制甲醛進一步氧化為甲酸,而甲酸會造成DNA的降解,因此抗氧化劑的加入對基因組DNA的提取起著關鍵性作用。Paabo和Su也曾提出在提取過程中要加入DTT,以提高DNA的產率。同時,Baneljee等提出福爾馬林保存標本在空氣中暴露時間越長,福爾馬林發(fā)生氧化程度就越大,其提取的DNA完整性就越低。徐來祥等的實驗也證明了這種觀點,保存時間較長的鰻鱺標本由于密封較好,氧化程度低,反而比保存時間短但密封性不好的倉鼠肝臟中提取的DNA更完整。1.3酚-氯反復抽提法DNA提取中回顧性的研究大多都是從石蠟包埋組織中提取的。經典的石蠟包埋組織DNA提取是用二甲苯脫蠟,蛋白酶K消化,酚-氯仿反復多次抽提,這種方法不僅操作復雜,污染大,而且提取的DNA部分斷裂,丟失,嚴重影響實驗結果,為此,很多學者做了進一步的改進。如:經典的快速提取DNA方法是沒有經過酚-氯仿反復抽提,直接將含有蛋白酶K的裂解液置于37℃恒溫水浴3h后,95℃加熱10min,1400r/min離心5min即可,這種方法既避免了酚-氯仿反復抽提對人體的傷害,同時也簡化了步驟,提高效率。叢娟等在此基礎上進行了部分改進:將含有蛋白酶K裂解液的標本,置于70℃恒溫水浴,再將消化過程中的標本置于55℃恒溫水浴過夜,后再經酚-氯仿反復抽提,也得到了較純的DNA產物,但操作還是相當復雜,易污染。高凌云等又提出了一種簡易的提取方案,此方法不用二甲苯脫蠟,而加入了非離子去污劑Tween20,通過改變細胞膜表面的張力,來加強蛋白酶K對蛋白質的降解作用。避免了傳統(tǒng)二甲苯脫蠟造成DNA破壞,引起PCR產物陽性率降低,減少了二甲苯對人體的危害,同時,提取的整個過程在一個EP管中完成,避免了繁瑣而費力的酚-氯仿反復抽提造成的DNA丟失和污染,保證PCR反應的質量,還可以處理大量標本,達到快速、經濟目的。2非損傷性取樣:量遺傳物質檢測新方法80年代中期以來,由于PCR技術的廣泛應用,已經能對極少量遺傳物質進行檢測,由此產生了一類新的取樣方法——非損傷性取樣(noninvasivesampling)。這種方法的樣品來源可以是動物的皮張標本、脫落的毛發(fā)、糞便、尿液等。2.1價金屬離子絡合利的作用從陳舊皮張中提取DNA,目前,已有不少學者在某些實驗對象上取得了成功,但往往都過于煩瑣、實驗周期長,因此,很多學者希望能找到更好的提取方案。饒剛等認為在提取過程中加入Chelex(螯合樹脂)能提高DNA的產率,在高溫條件下一些金屬離子可以作為DNA降解的催化劑作用,而Chelex是一種對多價金屬離子具高親合力的一種螯合樹脂,能通過螯合這些金屬離子來阻止DNA的降解,這樣可從微量樣品中得到較高分子量的DNA。同時,由于陳舊皮張中含有大量的角蛋白、膠原蛋白等對蛋白酶K有著較強耐受性的蛋白,為了能很好地消化材料,繞剛等又提出了在對標本前處理時,消化液組分中以鈣鹽代替鈉鹽,這是由于蛋白酶K有兩個Ca2+結合位點,它們與催化機理雖無直接關系,但如果從該酶中除去Ca2+,由于出現(xiàn)遠程的結構變化,催化活性將喪失80%左右。所以,加入含Ca2+的消化液,增強消化液的消化效果,可以使實驗周期成倍縮短,也簡化了操作步驟。同樣,為了更好地消化材料,蘭宏等采用了含有膠原蛋白和胰蛋白酶的PBS消化液,這是由于膠原蛋白能在適當?shù)臈l件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構;而胰蛋白酶能選擇地水解蛋白質中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈,能消化溶解變性蛋白質。同時,Paabo認為從動物死亡到標本完全干燥的時間越長,標本保留的DNA分子就越大,這點對于DNA提取成敗也起著關鍵性作用。2.2不同提取方法所獲得dna的量和時間及對pcr過程的影響從毛發(fā)中提取DNA,相關報道已有很多。余艦等在蛋白酶K(56℃)作用下,采用酚-氯仿反復抽提法就已經從毛發(fā)中提取了微量的DNA。徐艷春等和伍新堯等用Chelex-100處理毛發(fā)制備DNA,達到1根毛發(fā)提取得到的DNA即可得到較好的實驗結果,但用此方法對毛囊細胞裂解不夠徹底,殘留的消化液對后繼的PCR過程有一定的影響。而后,李軍林等在常規(guī)的酚-氯仿提取法的基礎上加以優(yōu)化,以pH8.8Tris-HCl、MgCl2溶液和蛋白酶K為裂解液消化,使其獲得了較高質量的DNA。趙春江等在此基礎上加以改進,以常用的PCR緩沖液、MgCl2溶液和蛋白酶K為裂解液,在PCR上設置一個單循環(huán)程序:65℃30min,95℃15min,4℃10min,而后瞬時離心PCR管,上清液即可做PCR模板。此法采用的較高消化溫度(65℃),可使蛋白酶K在較短時間內高效地消化毛囊中的蛋白質,使細胞釋出DNA;PCR的緩沖液中含有的Tris堿和PCR緩沖液的pH值,可在DNA提取過程中起到保護DNA、防止降解的作用;在PCR儀上,95℃15min過程可使蛋白酶K滅活,防止過剩的蛋白酶K在PCR過程中消化Taq酶而使PCR擴增無法進行。該方法可以用于大量標本的處理,且效果較好。2.3血液dna的提取從血液樣本中提取DNA關鍵是去除紅細胞及蛋白質。常規(guī)的方法是:先得到淋巴細胞,再用蛋白酶K、SDS消化,然后用酚氯仿抽提、乙醇沉淀。但此方法操作復雜,且試劑對身體有害,不少學者做了進一步的改進。趙權等采用TritonX-100破碎紅細胞和白細胞,直接得到白細胞核,然后用NaClO4,SDS解聚核蛋白,而不用蛋白酶K,最后用PCl(酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1)抽提,乙醇沉淀。此方法在去除紅細胞方面有了較大提高?；艚瘕埖仍诔Ｒ?guī)方法的基礎上又提出了用含有NH4Cl的等滲溶液破碎去除紅細胞。這種方法雖然也很好地去除了紅細胞,但操作等方面還是很復雜。吳清敏等結合他們方法稍做改進,用含有NH4Cl裂解液和含Tris-Cl的核裂解液逐步對樣本做處理,同時用蛋白酶K消化,并在54℃水浴2h,加入6mol/LNaCl,而后離心的上清液經沉淀洗滌,就獲得了較純的DNA產物。此后,趙嘉惠等又提出了TKM血液DNA提取法,此法利用紅細胞對低滲環(huán)境較為敏感,在去污劑NP-40存在下極易被破壞的原理,在溶液中加入NP-40;在高滲狀態(tài)下,強陰離子去污劑SDS可將其他血細胞及其細胞器破壞殆盡,經離心將細胞碎片及其他雜質除去,從而達到純化DNA的目的。而后,戴文申等提出了用Chelex-100