作物遺傳的基因克隆方法

作物遺傳的基因克隆方法

隨著植物遺傳水平的提高和生物新品種的迫切需要，結(jié)果表明，育種材料的遺傳多樣性、父母選擇指標(biāo)和后代評估方法提出了更高的要求。因此從表現(xiàn)型選擇到基因型鑒別,特別是對有益基因定位、克隆、轉(zhuǎn)移和累加,是人們?yōu)楂@取高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗新品種(系)而應(yīng)該關(guān)注的研究工作。然而無論對于控制質(zhì)量性狀的單(寡)基因還是與大多數(shù)農(nóng)藝性狀有關(guān)的微效多基因來說,對其進(jìn)行克隆都需要建立和發(fā)展相關(guān)的技術(shù)和方法?，F(xiàn)代遺傳學(xué)的發(fā)展為建立基因克隆新技術(shù)提供了理論指導(dǎo)。從遺傳學(xué)的觀點(diǎn)來看,克隆基因的途徑可概括為正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)兩種。正向遺傳學(xué)途徑指的是通過被克隆基因的產(chǎn)物或表現(xiàn)型突變?nèi)ミM(jìn)行;反向遺傳學(xué)途徑則指的是依據(jù)被克隆基因在染色體上的位置來實(shí)現(xiàn)。由于絕大多數(shù)控制重要農(nóng)藝性狀的基因產(chǎn)物及調(diào)控機(jī)制尚不清楚,走正向遺傳學(xué)之路困難較多,而反向遺傳學(xué)途徑則顯示出較好的前景。循反向遺傳學(xué)途徑克隆基因有三種主要方法可資利用,分別是轉(zhuǎn)座子示蹤法、隨機(jī)突變體篩選法和圖位克隆法。其中,轉(zhuǎn)座子受其種類、活性、數(shù)量的制約,隨機(jī)突變體篩選法則隨機(jī)性較大且不能控制失活基因的種類和數(shù)量,也限制了其使用。比較而言,圖位克隆法隨著相關(guān)配套技術(shù)的日漸成熟,數(shù)十個(gè)與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)的作物基因已被成功的克隆(表1)。本文擬對圖位克隆的研究進(jìn)展做一介紹,以期對植物遺傳育種和分子生物學(xué)研究有所助益。1pcr擴(kuò)增及構(gòu)建基因dna序列圖位克隆(Map-basedcloning)又稱定位克隆(positionalcloning),1986年首先由劍橋大學(xué)的Alancoulson提出,用該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行的,無需預(yù)先知道基因的DNA順序,也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息,但應(yīng)有以下兩方面的基本情況:一是有一個(gè)根據(jù)目的基因的有無建立起來的遺傳分離群體,如F、DH、BC、RI等。二是開展以下幾項(xiàng)工作:1)首先找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記;2)用遺傳作圖和物理作圖將目標(biāo)基因定位在染色體的特定位置;3)構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫(BAC庫或YAC);4)以與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫;5)用獲得陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的跨疊群;6)通過染色體步行、登陸或跳躍獲得含有目標(biāo)基因的大片段克隆;7)通過亞克隆獲得含有目的基因的小片段克隆;8)通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目標(biāo)基因的堿基序列。下面將對其中幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)予以敘述。2圖像鎖的技術(shù)鏈接2.1分離群體分組分析法用于作圖群體的類型可有多種。一般說來,在這類群體中,異花授粉植物分子標(biāo)記的檢出率較自花授粉植物的高。但是對于基因的圖位克隆而言,培育特殊的遺傳群體是篩選與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這些遺傳材料應(yīng)該滿足這樣的條件:即除了目標(biāo)基因所在座位的局部區(qū)域外,基因組DNA序列的其余部分都是相同的,在這樣的材料間找到的多態(tài)性標(biāo)記才可能與目標(biāo)基因緊密連鎖。目標(biāo)基因的近等基因系(NILs)是符合條件的一類群體。近等基因系是指幾乎僅在目標(biāo)性狀上存在差異的兩種基因型個(gè)體,這可通過連續(xù)回交的途徑獲得。由于NILs的遺傳組成特點(diǎn),一般凡是能在近等基因系間揭示多態(tài)性的分子標(biāo)記就極有可能位于目標(biāo)基因的兩翼附近。Martin等(1993)就是用RAPD技術(shù)分析番茄Pto基因的近等基因系而獲得了與該基因表現(xiàn)共分離的分子標(biāo)記,以該分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫而實(shí)現(xiàn)了染色體登陸。目前我們利用AFLP技術(shù)分析玉米CMS-S型雄性不育的恢復(fù)基因及近等基因系,已獲得與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記并以其用作分離Rf3基因的探針。一般說來,當(dāng)標(biāo)記為顯性遺傳時(shí),欲獲得最大遺傳信息量的F2群體,須借助于進(jìn)一步的子代測驗(yàn),以分辨F2中的雜合體。為此,Michelmore等(1991)發(fā)明了分離群體分組分析法(bulkedsegregantanalysis,BSA)以篩選目標(biāo)基因所在局部區(qū)域的分子標(biāo)記。其原理是將目標(biāo)基因的F2(或BC)代分離體的各個(gè)體僅以目標(biāo)基因所控制的性狀按雙親的表型分為兩群,每一群中的各個(gè)體DNA等量混合,形成兩個(gè)DNA混合池(如抗病和感病、不育和可育)。由于分組時(shí)僅對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇,因此兩個(gè)DNA混合池之間理論上主要在目標(biāo)基因所在局部區(qū)域的差異,這非常類似于NILs,故也稱作近等基因池法。研究表明,近等基因系法,分離群體分組分析法再結(jié)合AFLP等強(qiáng)有力的分子標(biāo)記技術(shù)使人們能夠在短時(shí)間內(nèi)從數(shù)量眾多的分子標(biāo)記中篩選出與目標(biāo)基因緊密連鎖的標(biāo)記。更為有意義的是,這種策略在尚未構(gòu)建遺傳圖譜的物種中也是可行的。2.2分子標(biāo)記的選擇實(shí)現(xiàn)基因圖位克隆的關(guān)鍵是篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。實(shí)質(zhì)上,分子標(biāo)記是一個(gè)特異的DNA片段或能夠檢出的等位基因,對其有效地利用即可達(dá)到圖位克隆基因之目的。迄今為止,已有幾十種技術(shù)可用于分子標(biāo)記的篩選(見表2)。這些技術(shù)有別于最初的形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記,一般表現(xiàn)出穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn),有的使用成本也相對較低,特別適用于篩選與目標(biāo)基因緊密連鎖的標(biāo)記,尤其是與目標(biāo)基因共分離的標(biāo)記。因此能夠加快克隆基因的進(jìn)程,研究者可依據(jù)不同的研究目標(biāo)、對象、目的、條件等,選擇使用這些技術(shù)。值得提及的是隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,一些植物的遺傳圖譜構(gòu)建和比較基因組的研究也有了長足的進(jìn)步,它們相得益彰,互為促進(jìn),為基因的圖位克隆提供了有益的借鑒。2.2.1高密度分子連鎖圖的應(yīng)用當(dāng)基因圖位克隆策略剛剛提出的時(shí)候,植物分子連鎖圖譜的構(gòu)建尚處于萌芽階段,當(dāng)時(shí)找到一個(gè)與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記通常要花費(fèi)數(shù)月甚至數(shù)年的時(shí)間。在過去的十年里,這種狀況有了顯著改善,由于可以很方便的建立和維持建圖所必需的較大的分離群體,因而植物分子連鎖圖構(gòu)建工作的發(fā)展速度超過了動(dòng)物的同類研究?，F(xiàn)在業(yè)已建圖的植物已多達(dá)幾十種,其中包括了所有重要的農(nóng)作物,水稻,玉米,蕃茄,小麥,馬鈴薯,擬南芥等重要經(jīng)濟(jì)作物和模式植物的遺傳圖譜已相當(dāng)精細(xì),含有數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)標(biāo)記。高密度分子連鎖圖的繪制為篩選與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記提供了良好的開端。比如,蕃茄的遺傳圖譜含有1000個(gè)分子標(biāo)記,其基因組大小約為1000×106bp(即1000×1000kbp),因此對任何基因,都可以找到與之相距在1000kbp之內(nèi)的分子標(biāo)記。2.2.2模式植物的基因組比較基因組研究主要是利用相同的DNA分子標(biāo)記(主要是cDNA標(biāo)記和基因克隆)在相關(guān)植物種之間進(jìn)行遺傳或物理作圖,比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布特點(diǎn),揭示染色體或染色體片段上的基因及其排列順序的相同(共線性)或相似性(同線性),并由此對相關(guān)物種的基因組結(jié)構(gòu)和起源進(jìn)化進(jìn)行分析。已有的研究表明,存在生殖隔離的不同植物物種之間在標(biāo)記探針的同源性,拷貝數(shù)及連鎖順序上都具有很大程度的保守性。如番茄,馬鈴薯和辣椒;水稻、小麥和玉米;小麥、黑麥和大麥;高粱和玉米;擬南芥和蕓薹屬;以及大麥和水稻。更為有趣的是,Moore等(1995)同時(shí)對水稻、小麥、玉米、谷子、甘蔗及高粱等6種主要禾本科物種的基因組進(jìn)行了比較作圖研究,結(jié)果表明其中基因組最小的水稻居于中樞的位置,即這些禾本科植物基因組的保守性可歸結(jié)到水稻基因組的19個(gè)連鎖區(qū)段上。由這19個(gè)區(qū)段可實(shí)現(xiàn)對所研究的全部禾谷類作物染色體的重建,并可構(gòu)成一個(gè)禾谷類作物祖先種的染色體骨架。通過這一研究,人們對禾谷類作物的進(jìn)化演變歷程有了更深入的認(rèn)識。植物比較基因組十年的研究成果表明,在更廣的范圍上,包括禾本科、十字花科、豆科植物及一些樹木的基因組在基因組成和基因排列順序上都存在很大程度的一致性。而在包括小麥、玉米和水稻等重要農(nóng)作物的禾本科作物上,基因組成和排列順序的一致性非常完好,人們可以在模式植物水稻上用圖位克隆技術(shù)克隆相關(guān)物種的大多數(shù)重要基因。此外,比較基因組研究還給人們一個(gè)重要的啟示,那就是模式植物上遺傳作圖的成果可推而廣之,這對那些遺傳作圖工作相對滯后的植物尤其重要。比較基因組作圖使我們建立高密度遺傳連鎖圖可資利用的標(biāo)記顯著增加。從而大大提高獲取離目標(biāo)基因很近的分子標(biāo)記的可能性。2.3篩選后的分子標(biāo)記一旦把目標(biāo)基因定位在某染色體的特定區(qū)域后,接下來就要對其進(jìn)行精細(xì)的作圖及篩選與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。目前的作圖類型分為兩類,分別是遺傳圖譜和物理圖譜。2.3.1精細(xì)表面活性劑的應(yīng)用染色體的交換與重組是遺傳圖譜構(gòu)建的理論基礎(chǔ),通過作圖群體的分析,如果一個(gè)基因與兩側(cè)最近的分子標(biāo)記距離均在2cM以上,就需要作精細(xì)的遺傳圖譜。因?yàn)榧词故窃谛』蚪M水稻中,平均1cM也相當(dāng)于250kb左右的物理距離,如果在著絲粒附近就可能相當(dāng)于1000kb左右,需要進(jìn)行若干步的染色體步行,非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力,因此,精細(xì)的遺傳圖譜對圖位克隆顯得非常重要,而增加遺傳圖譜上的分子標(biāo)記數(shù)目是精細(xì)作圖的基礎(chǔ)。在一個(gè)已知區(qū)域內(nèi)增加分子標(biāo)記有兩種方法,第一種方法是整合已有的遺傳圖譜。如將生理、生化、分子標(biāo)記圖在同一區(qū)域內(nèi)整合在一起,就會(huì)提高分子標(biāo)記的密度。另一種方法是尋找新的分子標(biāo)記。在植物上,精細(xì)作圖的發(fā)展速度超過了動(dòng)物的同類研究,這主要是因?yàn)樵谥参锷峡珊芊奖愕亟⒑途S持較大的分離群體,并建立了幾種不同的檢測標(biāo)記間連鎖關(guān)系的統(tǒng)計(jì)軟件。現(xiàn)在,業(yè)已建圖的植物已多達(dá)幾十種,其中包括了所有重要的農(nóng)作物(Tanksley,1995),如玉米、番茄、水稻、小麥、大麥、燕麥、大豆、高粱、油菜、萵苣、馬鈴薯等。尤其值得一提的是,過去被公認(rèn)為難以開展遺傳作圖的木本植物,如今也涌現(xiàn)出了許多密度可觀的分子標(biāo)記連鎖圖,如蘋果和松樹等。由于許多科學(xué)家的共同努力和連年的工作積累,已有越來越多生物的遺傳圖譜趨于飽和,這就為生物的物理圖譜的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。2.3.2熒光原位雜交技術(shù)由于分子標(biāo)記與目標(biāo)基因之間的實(shí)際距離是按堿基數(shù)(bp)來計(jì)算的,它會(huì)因不同染色體區(qū)域基因重組值不同而造成與遺傳距離的差別,所以物理圖譜是真正意義上的基因圖譜。物理圖譜的種類很多,從簡單的染色體分帶圖到精細(xì)的堿基全序列都是物理圖譜。最為常用的物理圖譜有限制酶切圖譜、跨疊克隆群和DNA序列圖譜等。限制酶切圖譜是用幾種限制性內(nèi)切酶消化DNA,通過電泳檢查限制性片段長度的辦法確定它們的排列順序;對于較大的基因組,可以利用稀有切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶和脈沖電脈。制作跨疊克隆群則需具有一定容量的大片段基因組文庫。比較各個(gè)克隆的插入片段,將它們排列成與原來在染色體中的順序一樣的連續(xù)克隆群。即跨疊克隆群(也叫重疊克隆群)。跨疊克隆群的制作方法有三種:1)菌落雜交法。其基本原理是利用基因組某一區(qū)域特有的或與所需分離的目標(biāo)基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記為探針篩選大片段基因組文庫,可以分別得到一系列的陽性克隆,這些克隆之間有部分片段是重疊的,根據(jù)其重疊部分可以把它們有序地呈線狀排列成跨疊群(contig)。在兩個(gè)跨疊群之間會(huì)出現(xiàn)空隙,需要通過染色體步行來填補(bǔ)。該技術(shù)從分離大片段陽性克隆群的左、右末端入手,以它們?yōu)樘结樤俅魏Y選基因組文庫,獲得新的克隆即為沿著染色體向前走了一步,重復(fù)這一過程,就能一步一步地將空隙填滿,將兩個(gè)克隆群整合在一起,這一方法能利用各種分子標(biāo)記掃描文庫,準(zhǔn)確得到攜帶分子標(biāo)記的陽性克隆,是構(gòu)建跨疊克隆群的首選策略。2)PCR法。即以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了一系列技術(shù),包括STS、RAPD、AFLP和Alu-PCR等已被廣泛應(yīng)用于跨疊克隆群的構(gòu)建。STS策略是利用已知核苷酸序列,從兩端合成兩個(gè)與其配對的引物,利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增,理論上講具有相同擴(kuò)增帶型的克隆,也可以說共享一個(gè)或數(shù)個(gè)STS位標(biāo)的克隆肯定是跨疊的。這個(gè)方法具有簡便、快速、精確度高等優(yōu)點(diǎn),是人類基因組計(jì)劃所采用的主要策略之一。另一重要的基于PCR的策略是Alu-PCR技術(shù),該技術(shù)利用人類基因組的Alu重復(fù)序列,合成一對特異性引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后以PCR產(chǎn)物為探針,從文庫中篩選出陽性克隆。這一方法簡便,但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一些誤差,當(dāng)與限制性內(nèi)切酶物理圖譜結(jié)合使用時(shí),就可以比較精確地排列出陽性克隆的重疊順序。3)DNA指紋-錨標(biāo)法。其原理是:首先對隨機(jī)克隆的DNA選定一個(gè)6堿基識別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化,然后用放射性同位素進(jìn)行末端標(biāo)記,經(jīng)標(biāo)記后DNA片段用另一個(gè)4個(gè)堿基識別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化,用序列分析膠分離這些片段,然后經(jīng)放射性自顯影檢測。這些指紋圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后,根據(jù)片段的相似性,構(gòu)建跨疊克隆群。熒光原位雜交技術(shù)(Fiber-FISH)是最近幾年新發(fā)展的方法,它使FISH技術(shù)的分辨力接近其理論值1Kb(相當(dāng)于～0.14μm的DNA纖絲),即光學(xué)顯微鏡的識別范圍內(nèi)。Fiber-FISH適宜于基因組的數(shù)量作圖。而且由于可以在熒光顯微鏡下同時(shí)觀察幾種探針的位置和順序,將有效地排除染色體步行過程中經(jīng)常遇到的復(fù)重序列帶來的困難。這些物理圖譜的構(gòu)建,無疑給圖位克隆感興趣的基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2.4柯斯質(zhì)粒的人工染色體技術(shù)高質(zhì)量的大片段基因組文庫是基因圖位克隆的另一關(guān)鍵。圖位克隆的基因組文庫主要是柯斯質(zhì)粒文庫或人工染色體文庫。雖說圖位克隆在理論上適用于任何物種,主要還是用于真核生物。真核生物一般都有內(nèi)含子,一個(gè)基因往往長達(dá)幾個(gè)到幾十個(gè)Kb,只有容納大片段插入子的克隆載體,才能攜帶完整的基因?？滤官|(zhì)粒從λ噬菌體改造而來。由于采用質(zhì)粒的復(fù)制子,柯斯質(zhì)?？朔税b的限制,插入片段可達(dá)40～50Kb。雖然如此,柯斯質(zhì)粒還是不敷應(yīng)用,就又發(fā)展了人工染色體技術(shù)。人工染色體在細(xì)胞周期中可以正常復(fù)制,配對和分離。作為載體,人工染色體的插入片段可達(dá)2Mb左右,能夠覆蓋完整的真核基因。最早發(fā)展的人工染色體是YAC。1983年,Murray等首次構(gòu)建了總長度為55Kb的YAC。1987年,Burke等得到了能夠克隆大片段DNA的YAC載體,證明YAC可以構(gòu)建高等生物的完整基因組文庫。YAC具有比較大的容納能力,但不太穩(wěn)定,嵌合體比例也較高,而且難與酵母自身的染色體分開。后來陸續(xù)發(fā)展了P1、BAC、PAC等幾種以細(xì)菌為寄主的載體系統(tǒng)。值得提及的是進(jìn)展一直緩慢的哺乳動(dòng)物人工染色體(MAC)和人類人工染色體(HAC)也已取得突破性進(jìn)展。2.5通過染色體在線或跳步和連接求取目標(biāo)基因的克隆找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記(最好分布在基因兩側(cè))和鑒定出分子標(biāo)記所在的大片段克隆以后,接著是以該克隆為起點(diǎn)進(jìn)行染色體步行,逐漸靠近目標(biāo)基因,以該克隆的末端作為探針篩選基因組文庫,鑒定和分離出鄰近的基因組片段的克隆,再將這個(gè)克隆的遠(yuǎn)端末端作為探針重新篩選基因組文庫。繼續(xù)這一過程,直到獲得具有目標(biāo)基因兩側(cè)分子標(biāo)記的大片段克隆或跨疊群。如果目標(biāo)基因所在區(qū)域已經(jīng)完成分子作圖,就有一套現(xiàn)成的順序排列的大片段克隆可以利用。當(dāng)遺傳連鎖圖譜指出基因所在的特定區(qū)域時(shí),即可取回需要的克隆,獲得目標(biāo)基因。染色體步行的主要困難在于,當(dāng)必須經(jīng)過一個(gè)無法克隆的片段時(shí)(如對寄主無害),步行的過程會(huì)被打斷;當(dāng)克隆的一端是重復(fù)序列時(shí),步行的方向會(huì)步入歧途。為了克服這些困難,發(fā)展了染色體登陸、跳步和連接等方法。染色體登陸是找出與目標(biāo)基因的物理距離小于基因組文庫插入片段的平均距離還小的分子標(biāo)記,通過篩選文庫直接獲得含有目標(biāo)基因的克隆,完全避開染色體步行的過程。染色體跳步—連接是使用一個(gè)識別位點(diǎn)很少的酶和一個(gè)識別位點(diǎn)很多的酶構(gòu)建跳步文庫和連接文庫。跳步文庫的插入片段是大片段克隆末端經(jīng)過雙酶切的部分,由同樣的文庫進(jìn)行克隆。連接文庫的插入片段是由切點(diǎn)較少的酶產(chǎn)生的,具有切點(diǎn)較少的那個(gè)酶的識別位點(diǎn)。在染色體步行的過程中,交替應(yīng)用兩個(gè)文庫進(jìn)行跳步和連接,最終逼近目標(biāo)基因。2.6定位克隆技術(shù)關(guān)鍵環(huán)節(jié)在與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記及大插入片段基因組文庫都具備的情況下,就可以該分子標(biāo)記為探針通過菌落雜交,藍(lán)、白斑挑選的方式篩選基因組文庫而獲得可能含有目標(biāo)基因的陽性克隆。這些陽性克隆中可能含有多個(gè)侯選基因,從一系列侯選基因中鑒定基因是定位克隆技術(shù)的最后一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。現(xiàn)在最常用的方法是用含有目標(biāo)基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去篩選cDNA文庫,并查詢生物數(shù)據(jù)信息庫,待找出侯選基因后,把這些侯選基因進(jìn)行下列分析以確定目標(biāo)基因:(1)精確定位法檢查cDNA是否與目標(biāo)基因共分