無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測聯(lián)合血清學產(chǎn)前篩查在產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體中的應用

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測聯(lián)合血清學產(chǎn)前篩查在產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體中的應用

中國是一個出生缺陷嚴重的國家。每年新增出生缺陷120萬，每年約占人口的4.6%。21號和13號染色體綜合征是人類最常見的三種染色體疾病。孩子的臉很特殊。大多數(shù)兒童患有嚴重的精神障礙和器官畸形，這對家庭和社會有重大影響和負擔?，F(xiàn)代醫(yī)學對胎兒染色體疾病尚無有效的治療方法,最好的方法是在孕期通過產(chǎn)前篩查及診斷,發(fā)現(xiàn)異常并及時采取相應措施。但是臨床常用的產(chǎn)前篩查方法存在較高的假陽性率和漏檢率,而介入產(chǎn)前診斷雖準確率高,卻可能導致胎兒宮內(nèi)感染和流產(chǎn),難以被廣大孕婦和家庭所接受。隨著高通量測序技術的發(fā)展,無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷應運而生。本研究通過對792例血清學篩查高危孕婦,采用無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的方法進一步篩查,顯著降低了假陽性率和漏檢率?，F(xiàn)將結果報道如下。1對象和方法1.1血清學篩查結果2013年5月-2013年12月,我院對14098例孕婦進行了血清學篩查,結果為21-三體和(或)18-三體的單胎孕婦有792例,孕周均在12-26w,知情同意后,全部進行無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測。1.2方法1.2.1互通日期篩查孕婦清晨空腹時采集靜脈血3ml,使用一次性無抗凝劑真空采血管,8小時內(nèi)盡快處理分離血清,血清在4℃下可保存一周,-20℃下可保存一個月。采用時間分辨熒光檢測法,確定孕婦的出生年月、孕周(14-21w)、體重、民族、既往病史等參數(shù),將其輸入篩查檢測軟件,進行產(chǎn)前篩查。本實驗室21-三體篩查風險切割值(cut-off值)為1/270,篩查風險≥1/270判斷為21-三體篩查高風險,18-三體綜合征風險切割值為1/350,篩查風險≥1/350,判斷為18-三體綜合征高風險,反之判斷為18-三體綜合征低風險。1.2.2離心血漿分離無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測主要包括血漿分離、DNA提取、文庫構建、cBot成簇反應、測序及數(shù)據(jù)分析等過程。知情同意后,采用EDTA-K2抗凝管抽取孕婦外周血5ml,4℃冰箱保存,并于8小時內(nèi)進行血漿分離,4℃以1600g離心10min,將上清液分裝到2個2ml離心管中,4℃以16000g再次離心10min,所得上清液轉入4個新的已編號的2ml離心管中,每個離心管轉入600μl血漿,血漿樣本總量不少于2ml,同時貼上相應的條形碼。分離后的血漿在-20℃冰箱中可保存3天,長期保存需存放于-80℃冰箱。采用TIANampMicroDNAKit提取血漿DNA,以BGI-ShenzhenNIFTYLibraryConstructionKit試劑盒進行文庫構建,cBot成簇反應后,采用Illumina公司的Hiseq2000測序儀進行全基因組測序,利用BGI-ShenzhenNIFTY軟件進行數(shù)據(jù)分析,計算胎兒患病風險。1.2.3核分析中的染色體類型無創(chuàng)高危孕婦采用B超介導下經(jīng)腹穿刺術獲得絨毛、羊水或臍血等標本,通過細胞培養(yǎng)G顯帶染色體核型分析,進行產(chǎn)前診斷。2險孕產(chǎn)婦染色體核型的發(fā)現(xiàn)792例生化血清學篩查高危的孕婦進行無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷,檢出高風險14例,高危檢出率為1.77%,其中6例21-三體,3例18-三體,5例性染色體異常。14例高風險孕婦通過穿刺取樣進行染色體核型確診,結果顯示,5例確診為21-三體,另外1例21-三體孕婦因孕婦胎盤前置,產(chǎn)前介入診斷禁忌,時孕周28周,孕婦堅持足月分娩,采集出生后嬰兒外周血進行核型分析,確診為21-三體;3例18-三體均經(jīng)核型確診。因此,無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷對21-三體及18-三體的檢測準確率為100%。但5例性染色體異常只有1例確診為47,XXY,與無創(chuàng)產(chǎn)前結果一致,其余4例的核型結果顯示無結構及數(shù)目異常。對778例無創(chuàng)檢測陰性的孕婦進行隨訪,目前未發(fā)現(xiàn)染色體非整倍體異常的患兒。3無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術目前染色體病尚無有效治療方法,唯一有效的措施為廣泛開展產(chǎn)前篩查與診斷,傳統(tǒng)的臨床篩查是通過血清學生化篩查,而目前通用母體血清學篩查由于缺乏中國孕婦人群各項篩查指標的正常值范圍,從而無法確定產(chǎn)前篩查的高危切割值。另外,母體血清產(chǎn)前篩查各指標的檢測方法中,酶免法(ELISA)最為常用,但采用該法進行定量檢測時,易受很多因素影響,結果變異較大,導致各個醫(yī)療單位所采用的診斷指標差異很大,其靈敏性和特異性欠佳,假陽性率較高,嚴重影響了國內(nèi)中孕期產(chǎn)前篩查的準確率。目前,傳統(tǒng)的產(chǎn)前基因診斷方法雖然為產(chǎn)前診斷的金標準,但該方法主要通過絨毛活檢、羊膜腔及臍靜脈穿刺術獲取胎兒遺傳物質,對于孕婦及胎兒均具有一定的創(chuàng)傷,容易導致宮內(nèi)感染,同時可導致0.5%~3%的流產(chǎn)率。1997年,Lo等在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)有胎兒游離DNA,為無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷技術的開展提供了理論依據(jù)。高通量測序技術的興起,使無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷技術由理論變成了現(xiàn)實。而且胎兒游離DNA在分娩后短時間內(nèi)將消失,平均半衰期為16.3min,2h后就無法檢出,因此,該技術對再次妊娠時的檢測結果沒有任何影響。2010年,Lun等運用大規(guī)模并行基因組測序法成功檢測出1例易位型21-三體。2011年,Chiu等應用無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測753例21-三體高風險的孕婦外周血,其中86例胎兒為21-三體高風險,與染色體核型進行比較分析,發(fā)現(xiàn)21-三體胎兒的檢出率為100%。本研究對792例生化血清學高危孕婦外周血進行無創(chuàng)產(chǎn)前基因組測序檢測,檢出6例21-三體綜合征,3例18-三體綜合征,檢出率均為100%。但性染色體檢測穩(wěn)定性欠佳,有研究認為是由于GC含量的干擾所致,JiangF等以標準Z-Score值為基礎,通過改進染色體內(nèi)標參照及計算方式,一定程度上降低了GC含量的影響,實現(xiàn)結果值變異系數(shù)小,提高和穩(wěn)定了18,13-三體及性染色體檢出率。因此采用無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術進行胎兒染色體異常篩查,符合臨床檢測要求,具有臨床實際應用價值。相較于血清學篩查,無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術覆蓋面廣(血清學篩查無法檢測13號染色體及性染色體變異),同時還具有準確性高、無創(chuàng)等優(yōu)點,尤其適用于試管嬰兒。此外,該技術還擁有良好的可擴展性,除染色體非整倍體外,將來還可能應用于胎兒染色體微缺失和微重復、單基因病、甚至全基因組的檢測。隨著全基因組測序技術的不斷進步和測序成本的不斷下降,基于全基因組測序的檢測技術擁有非常廣闊的發(fā)展空間,將向更加快速化、早期化和個性化邁進。本研究采用無創(chuàng)產(chǎn)前基