曲師大酶工程課件

第二章酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn)第二章酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn)

提取分離法微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶酶的生產(chǎn)方法生物合成法植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶化學(xué)合成法動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶

CompanyLogo第二章酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn)酶生物合成及調(diào)節(jié)1細(xì)胞的選擇及培養(yǎng)基的配制2產(chǎn)酶工藝條件及其調(diào)控3產(chǎn)酶的動(dòng)力學(xué)4CompanyLogo第一節(jié)酶生物合成及調(diào)節(jié)遺傳信息傳遞的中心法則蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNACompanyLogo一、酶的生物合成（一）RNA的生物合成--轉(zhuǎn)錄(transcription）

定義以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA分子的過程。（二）蛋白質(zhì)的生物合成--翻譯(translation）定義以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程CompanyLogo二、酶生物合成的調(diào)節(jié)（一）基因調(diào)控理論

JacobandMonod的操縱子學(xué)說（operontheory）

操縱子基因表達(dá)的協(xié)同單位結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì)structuralgeneS）操縱子操縱基因（operatorgeneO）控制部位啟動(dòng)子（promotorgeneP）CompanyLogo

調(diào)節(jié)基因

啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因

DNA

轉(zhuǎn)錄

（-）

RNA聚合酶（+）轉(zhuǎn)錄

翻譯

mRNA

翻譯

阻遏蛋白

蛋白質(zhì)

誘導(dǎo)劑

控制區(qū)信息區(qū)操縱子基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖CompanyLogo調(diào)節(jié)基因(regulatorgene)：

可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白(regulatoryprotein)

（一種變構(gòu)蛋白），通過與效應(yīng)物(effector)（包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游啟動(dòng)基因（promotorgene）（啟動(dòng)子）：有兩個(gè)位點(diǎn)：

（1）RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)（2）cAMP-CAP的結(jié)合位點(diǎn)。CAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。只有cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，RNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，酶的合成才能開始。

cAMP-CRP復(fù)合物的作用示意圖

CompanyLogo操縱基因（Operatergene）:

位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）:

決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。CompanyLogo(二)酶合成調(diào)節(jié)的類型

1.誘導(dǎo)

(induction)

組成酶：細(xì)胞固有的酶類。誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時(shí)合成的一類酶。

2.阻遏

(repression)

分解代謝物阻遏(cataboliterepression)

反饋?zhàn)瓒?feedbackrepression)CompanyLogo（三）酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制

1.酶合成的誘導(dǎo)加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶生物合成開始或加速進(jìn)行。酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象：已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；

-半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實(shí)驗(yàn)：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成；（2）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；（3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時(shí)才合成CompanyLogo調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因關(guān)閉啟動(dòng)子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（無活性）基因表達(dá)mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)

B、乳糖酶的誘導(dǎo)

乳糖阻遏蛋白（有活性）誘導(dǎo)CompanyLogo2.末端產(chǎn)物阻遏

由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。

酶合成阻遏的現(xiàn)象：

實(shí)驗(yàn)：

（1）大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)，檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長的經(jīng)濟(jì)原則:不需要就不合成。CompanyLogo色氨酸操縱子——酶的阻遏調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)CompanyLogo酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動(dòng)基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物CompanyLogo調(diào)控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng)舉例酶的誘導(dǎo)有活性－＋不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘導(dǎo)物－轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性－阻遏物＋不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比CompanyLogo3.分解代謝物阻遏指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。CompanyLogo分解代謝物阻遏現(xiàn)象：實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對數(shù)生長期中間隔開一個(gè)生長延滯期的“二次生長現(xiàn)象”(diauxie或biphasicgrowth）。這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。CompanyLogo分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達(dá)CAP基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)合部位

RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)CompanyLogo三、提高酶產(chǎn)量的策略（一）菌種選育（一勞永逸）

1.誘變育種

(1)使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型——選育組成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜瓦x育營養(yǎng)缺陷型突變株解除反饋?zhàn)瓒暨x育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏——選育抗分解代謝阻遏突變株

2.基因工程育種

CompanyLogo（二）條件控制1.添加誘導(dǎo)物酶的底物類似物最有效。2.降低阻遏物濃度

除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑避免使用葡萄糖分解代謝物阻遏避免培養(yǎng)基過于豐富添加一定量的cAMPCompanyLogo3.添加表面活性劑

離子型對細(xì)胞有毒害作用表面活性劑Tween－80

非離子型增加細(xì)胞通透性

TritonX－1004.添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑CompanyLogo第二節(jié)細(xì)胞的選擇基本原則：1、酶產(chǎn)量高2、容易培養(yǎng)和管理3、產(chǎn)酶穩(wěn)定性好4、利于酶的分離純化5、安全可靠現(xiàn)在大多數(shù)是微生物發(fā)酵生產(chǎn)，動(dòng)植物細(xì)胞占少數(shù)CompanyLogo一、微生物常用的種類：

大腸桿菌（Escherichiacoli)

細(xì)菌

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)CompanyLogo放線菌：鏈霉菌（Streptomyces)

啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae)

酵母菌

假絲酵母（Candida)CompanyLogo

黑曲霉（Aspergillusniger)

米曲霉

(Aspergillusorzae)

青霉菌

(Penicillium)霉菌

木霉

(Trichoderma)

根霉

(Rhizopus)

毛霉

(Mucor)

紅曲霉

(Monascus)CompanyLogo

產(chǎn)酶微生物的分離和篩選

1)樣品的采集:從富含該酶作用底物的場所采集樣品

2)富集培養(yǎng):投其所好，取其所抗

3)分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pureculture）。

4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。

5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質(zhì)為主。

CompanyLogo

-淀粉酶的篩選CompanyLogo蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基CompanyLogo產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育誘變育種原生質(zhì)體融合育種基因工程育種CompanyLogo二、植物細(xì)胞

糖苷酶胡蘿卜細(xì)胞－半乳糖甘酶紫苜蓿細(xì)胞漆酶假挪威槭細(xì)胞過氧化物酶甜菜細(xì)胞大豆細(xì)胞－葡萄糖苷酶利馬豆細(xì)胞酸性轉(zhuǎn)化酶甜菜細(xì)胞堿性轉(zhuǎn)化酶甜菜細(xì)胞糖化酶甜菜細(xì)胞苯丙氨酸裂合酶花生細(xì)胞大豆細(xì)胞木瓜蛋白酶番木瓜細(xì)胞超氧化物歧化酶大蒜細(xì)胞菠蘿蛋白酶菠蘿細(xì)胞劍麻蛋白酶劍麻細(xì)胞木瓜凝乳蛋白酶番木瓜細(xì)胞CompanyLogo

人黑色素瘤細(xì)胞

中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO)動(dòng)物細(xì)胞

小鼠骨髓瘤細(xì)胞

牛內(nèi)皮細(xì)胞CompanyLogo二、培養(yǎng)基的配制

碳源

氮源基本組分

無機(jī)鹽

生長因子CompanyLogo二、微生物培養(yǎng)基碳源一般為淀粉及水解產(chǎn)物，氮源一般是無機(jī)氮源和有機(jī)氮源的混合物，無機(jī)鹽和生長因子則根據(jù)需要添加，生產(chǎn)同一種酶，不同的地區(qū)、不同的企業(yè)中采用的培養(yǎng)基也有所不同，根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇和優(yōu)化CompanyLogo三、植物細(xì)胞1、植物細(xì)胞培養(yǎng)基特點(diǎn)：

(1)植物細(xì)胞的生長和代謝需要大量的無機(jī)鹽。

(2)多種維生素。

(3)一般無機(jī)氮源。

(4)蔗糖碳源2％－5％。CompanyLogo2.幾種常見培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基

B5培養(yǎng)基植物培養(yǎng)基

White培養(yǎng)基

KM-8P培養(yǎng)基CompanyLogo3.植物細(xì)胞培養(yǎng)基配制(1)大量元素母液(2)微量元素母液(3)鐵鹽母液(4)微生物母液

(5)植物激素母液CompanyLogo四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基（一）組分1、氨基酸2、維生素3、無機(jī)鹽4、葡萄糖5、激素6、生長因子CompanyLogo（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基組分復(fù)雜，首先配制各種母液，一般是過濾除菌，冷凍保藏，使用時(shí)稀釋。要確保各組分完全溶解，最好是現(xiàn)配現(xiàn)用。CompanyLogo第三節(jié)產(chǎn)酶工藝條件及其調(diào)控保藏細(xì)胞細(xì)胞活化細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)原生質(zhì)體固定化細(xì)胞產(chǎn)酶固定化原生質(zhì)體預(yù)培養(yǎng)無菌空氣培養(yǎng)基分離純化酶CompanyLogo一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)

斜面保藏砂土管保藏保藏方法真空冷凍干燥保藏低溫保藏石蠟油保藏培養(yǎng)時(shí)溫度、pH、溶解氧應(yīng)為最佳，培養(yǎng)到對數(shù)生長期，擴(kuò)培時(shí)接種量為1%－10%CompanyLogo二、pH的調(diào)節(jié)控制

細(xì)菌：pH6.5－8.0不同細(xì)胞的pH

霉菌和酵母菌：pH4－6

植物細(xì)胞：pH5.2－5.8

動(dòng)物細(xì)胞：pH7.2-7.6需要注意問題：產(chǎn)酶和生長最適pH有所不同，不同pH條件下，同一種細(xì)胞所產(chǎn)酶的比例也不同，由于細(xì)胞的繁殖和新陳代謝產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)基的pH也會(huì)發(fā)生變化CompanyLogo調(diào)節(jié)的方法：1.改變培養(yǎng)基的組分或其比例。2.緩沖液來穩(wěn)定。3.加入適量的稀酸、稀堿來調(diào)節(jié)。CompanyLogo三、溫度的調(diào)節(jié)控制

細(xì)菌：34－37℃不同細(xì)胞的真菌：28－32℃生長溫度

植物細(xì)胞：22－28℃

動(dòng)物細(xì)胞：36－37℃注意的問題：最適產(chǎn)酶溫度和最適生長溫度有所不同，往往低于最適生長溫度由于新陳代謝的作用，培養(yǎng)基溫度會(huì)發(fā)生變化CompanyLogo采用的方法：1.熱水升溫2.冷水降溫設(shè)計(jì)生物反應(yīng)器的時(shí)候應(yīng)該有足夠的傳熱面積的熱交換器，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等CompanyLogo四、溶解氧的調(diào)節(jié)控制溶解氧（solubleoxygen)是指溶解在培養(yǎng)基中的氧氣，由于氧氣難溶于培養(yǎng)基中，細(xì)胞很快就會(huì)利用完，因此需要不斷得對培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充。細(xì)胞對溶解氧的需要量與細(xì)胞呼吸強(qiáng)度以及培養(yǎng)基中細(xì)胞濃度密切相關(guān)。一般用耗氧速率來表示Ko2。CompanyLogoKo2=Qo2.CCKo2為耗氧速率，指單位體積（L，mL）培養(yǎng)液在單位時(shí)間（h，min）內(nèi)的耗氧量，（