第一章 基因工程的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

第一章基因工程的分子生物學(xué)基礎(chǔ)授課人：余春梅授課學(xué)院:南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程的概念細(xì)胞外用各種方法產(chǎn)生的核酸分子插入載體分子中，形成遺傳物質(zhì)的新組合，最終整合摻入到本來不含這些核酸分子的宿主生物中，并進(jìn)行復(fù)制繁衍。遺傳工程、基因操作、重組DNA技術(shù)等基因工程誕生的理論基礎(chǔ)----證明了DNA是遺傳物質(zhì)-----雙螺旋模型-----遺傳密碼子的破譯1）不同的基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)2）基因是可切割的3）基因是可以轉(zhuǎn)移的4）多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系5）遺傳密碼是通用的6）基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代?；蚬こ痰募夹g(shù)基礎(chǔ)工具酶：DNA連接酶內(nèi)切酶反轉(zhuǎn)錄酶PCR技術(shù)載體技術(shù)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)第三節(jié)基因工程中采用的主要酶類一、序列特異的DNA限制性內(nèi)切核酸酶

λ噬菌體E.coli菌株λKλCλBK110-410-4C10-4110-4B111（一）限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

—宿主細(xì)胞的限制和修飾作用1、宿主細(xì)胞的限制和修飾作用：兩種不同來源的入-噬菌體λK；λC，能高頻感染各自大腸桿菌宿主細(xì)胞（K株，C株）。當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)，感染下降數(shù)千倍。一但λK噬菌體在C株成功，由C株繁殖出λK后代，能感染C株,不能感染原來K株.(二)限制和修飾作用的分子機(jī)制1．大腸桿菌宿主細(xì)胞K株，C株，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。1）

它們均有三個(gè)連續(xù)的基因位點(diǎn)控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）

hsdR編碼限制性核酸內(nèi)切酶---識(shí)別DNA分子特定位點(diǎn)，將雙鏈DNA切斷。3）

hsdM編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位點(diǎn)的堿基甲基化反應(yīng)。4）

hsdS表達(dá)產(chǎn)物的功能是---協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶，識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)。(二)、限制和修飾作用的分子機(jī)制2.入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細(xì)胞K株，C株中，1）宿主細(xì)胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護(hù).2）封閉自身所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)（修飾）3．當(dāng)外來DNA入侵時(shí)，遭到宿主限制性內(nèi)切酶的特異降解（限制）4.由于降解不完全，外來少數(shù)DNA分子在宿主細(xì)胞中繁殖過程中被宿主細(xì)胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。5．但喪失在原宿主細(xì)胞中的存活能力，因?yàn)榻邮芰诵滤拗骶谆揎椀耐瑫r(shí)喪失了原宿主菌修飾的標(biāo)記(一但λK噬菌體在C株成功，由C株繁殖出λK后代，能感染C株,不能感染原來K株)6．細(xì)菌利用限制和修飾系統(tǒng)來區(qū)分自身DNA與外來DNA。B株不能產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶，其它來源入-噬菌體可以感染B株，在B株繁殖，入-噬菌體則在K株和C株受到嚴(yán)格的限制作用(二)限制和修飾作用的分子機(jī)制(三)限制性內(nèi)切酶的分類I類酶II類酶III類酶酶分子三亞基雙功能內(nèi)切酶與甲基化酶分離二亞基雙功能識(shí)別位點(diǎn)二分非對(duì)稱序列4-8bp序列，回文結(jié)構(gòu)5-7bp非對(duì)稱序列切割位點(diǎn)距識(shí)別位點(diǎn)1000bp在識(shí)別位點(diǎn)中或靠識(shí)別位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bp限制性反應(yīng)與甲基化反應(yīng)互斥分開反應(yīng)同時(shí)竟?fàn)幭拗谱饔眯枰枰恍枰ㄋ模┫拗菩詢?nèi)切酶Ⅱ切割特點(diǎn)1、識(shí)別位點(diǎn)一般為4-8個(gè)bp的回文序列大多數(shù)酶作用于底物DNA雙鏈，位點(diǎn)在識(shí)別序列中或靠近識(shí)別序列少數(shù)酶能作用于回文序列相應(yīng)DNA單鏈序列限制性內(nèi)切酶Ⅱ切割特異位點(diǎn)的機(jī)理（四）限制性內(nèi)切酶Ⅱ切割特點(diǎn)平末端：兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心，形成的DNA片段具有平末端。黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化起來。

5’突出的黏性末端

3’突出的黏性末端平末端的DNA片段不易重新環(huán)化已知有兩種不同的限制酶都可產(chǎn)生粘性末端：5’-P端突出：3’-OH端突出：同尾酶一組來源不同識(shí)別序列各異的，但能夠切割形成相同粘性末端的核酸內(nèi)切限制酶。HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’同裂酶（isoschizomers）有一些來源不同的限制性內(nèi)切酶能識(shí)別并切割相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。限制酶識(shí)別與切割的靶點(diǎn)序列及其隨后的連接同DNA的來源無關(guān)，即不帶有種的特異性，對(duì)各種DNA普遍適用。根據(jù)這一特性，才能將不同來源的DNA片段重組成新的重組體分子或是新的基因。從生物秀網(wǎng)站下載二、連接酶（一）DNA連接酶的作用模式1、連接酶：能夠催化兩條雙鏈DNA鏈之間形成5′，3′磷酸二酯鍵的酶5’－末端形成DNA－腺苷酸復(fù)合物（二）DNA連接酶的兩種類型類型I：E.coliDNA連接酶（只連接粘末端）利用NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）作為能量供體，主要來源于原核生物類型II：T4DNA連接酶（粘末端和平末端）

利用ATP作為能量供體，主要來源于真核生物，T4噬菌體也屬于此類在基因工程的實(shí)驗(yàn)中主要用T4DNA連接酶（三）條件（1）連接所需的條件一條DNA鏈的3’末端具有一個(gè)游離的羥基（-OH），而在另一條DNA鏈的5’末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（-P）；（2）需要有一種能源分子存在以提供羥基與磷酸基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵時(shí)所需的能量。大腸桿菌及其它細(xì)菌中：NAD+（氧化氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）動(dòng)物細(xì)胞及噬菌體中：ATPOH3’5’P（四）注意被連接的兩條DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分，DNA連接酶并不能連接兩條單DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子。DNA連接酶只能連接并封閉雙螺旋DNA分子所出現(xiàn)的切口（Nick），即封閉雙鏈DNA上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的斷裂GGTAC-OHP-CC-PHO-CATGG5’3’3’5’GG-OHP-CCCCATGG5’3’3’5’GGTACCCCATGG5’3’3’5’三、激酶及堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶：除去DNA5′磷酸的酶激酶：在DNA或RNA的5′羥基(OH)端進(jìn)行磷酸化的酶（作用結(jié)果是添加磷酸，可用于核酸的末端標(biāo)記）四、DNA聚合酶和RNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ（來自大腸桿菌）功能：5’→3’的聚合酶活性。5’→3’外切核酸酶活性，3’→5’外切核酸酶利用：5’→3’的聚合酶活性以及5’→3’外切核酸酶活性，切口平移大片段（Klenow片段）：5’→3’的聚合酶活性，3’→5’外切核酸酶小片段DNA聚合酶ⅠTaqDNA聚合酶（來自耐熱細(xì)菌）具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’外切核酸酶，高度保真，產(chǎn)生平末端，不能進(jìn)行TA克隆測(cè)序酶：具有5’→3’的聚合酶活性，但不具備3’→5’外切核酸酶的T7DNA聚合酶。反轉(zhuǎn)錄酶：以RNA為模板合成DNA的聚合酶第四節(jié)研究DNA和RNA的方法一、核酸的分離純化通過各種方法將生物材料破碎，釋放DNA（RNA）至溶液中，去除雜質(zhì)（如用苯酚萃取蛋白質(zhì)），再用乙醇沉淀核酸，通過離心，分離純化核酸，最后用低濃度鹽溶液溶解核酸。1、細(xì)菌培養(yǎng)物的生長和收集確定成分的培養(yǎng)基(definedmedium)，M9不確定成分的培養(yǎng)基(undefinedmedium)，如LB蛋白胨：提供氨基酸和小的肽段酵母提取物：提供氮源，糖類以及其它有機(jī)與無機(jī)營養(yǎng)實(shí)例1：細(xì)菌DNA的提取2、細(xì)胞提取物的制備細(xì)菌細(xì)胞的屏障:細(xì)胞膜和細(xì)胞壁物理方法與化學(xué)方法化學(xué)方法:溶菌酶(消化細(xì)胞壁多聚物)EDTA(螯合鈣離子,抑制DNA酶的活性)SDS:去污劑,協(xié)助細(xì)胞壁的裂解實(shí)例1：細(xì)菌DNA的提取3從細(xì)胞提取物中純化DNA降解雜質(zhì),留下DNA(苯酚與氯仿的混合物,RNA酶)離子交換層析,分離DNA(帶正電荷的離子交換劑)4DNA取樣的濃縮乙醇沉淀(破壞了DNA分子間的氫鍵)5DNA濃度的測(cè)量A260/A280=1.8實(shí)例1：細(xì)菌DNA的提取植物葉片用液氮碾磨成細(xì)末后轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管加650μl在65度預(yù)熱的CTBA提取液水浴鍋中65溫浴40分鐘后取出，靜置冷卻加入650μl苯酚：氯仿（1：1）混合液，上下顛倒混勻，靜置5分鐘12000rpm離心10分鐘實(shí)例2：植物DNA的提取取上清液，加入2μl（10mg/ml）Rnase,37度水浴30分鐘再抽提一次取上清液，加入2倍體積的冷乙醇或等體積的異丙醇輕輕搖動(dòng)，待發(fā)現(xiàn)有白色絮狀沉淀，用牙簽挑出或6000rpm離心5分鐘70%的乙醇洗后，涼干。

實(shí)例2：植物DNA的提取實(shí)例3質(zhì)粒DNA的制備1基于分子大小的分離2基于構(gòu)象的分離質(zhì)粒有三種構(gòu)型cccDNA(共價(jià)閉環(huán)DNA)：DNA的兩條鏈都是完整的。ocDNA(開環(huán)DNA)：只有一條鏈?zhǔn)峭暾?。線性DNA：DNA的兩條鏈均被打開。多種細(xì)菌中存在線性的質(zhì)粒DNA。但末端或是通過重復(fù)序列形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或通過共價(jià)結(jié)合蛋白進(jìn)行保護(hù)，避免核酸酶的降解。超螺旋DNA松弛cccDNA開環(huán)DNA核酸內(nèi)切酶DNA連接酶核酸內(nèi)切酶DNA促旋酶拓?fù)洚悩?gòu)酶堿變性用CsCl-EB等密度離心UpperbandcontainingchromosomalDNAandopenplasmidcirclesLowerbandofcovalentlyclosedcirclesplasmidDNAEthidiumbromide(EB)包含質(zhì)粒的細(xì)胞用溶菌酶弱化細(xì)胞壁，用NaOH和SDS溶液裂解變性的染色體DNA用acidicsodiumacetate中和染色體DNA復(fù)性形成不溶的網(wǎng)狀物高濃度的acidicsodiumacetate使protein-SDS復(fù)合物和高分子量的RNA沉淀cccDNA不發(fā)生變性，以天然狀態(tài)溶解在溶液中通過離心去除沉淀通過乙醇或異丙醇濃縮沉淀，或用凝膠過濾方法純化質(zhì)粒DNA。二、凝膠電泳根據(jù)DNA或RNA分子的大小，形狀和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，將DNA和RNA進(jìn)行分離的技術(shù)。DNA和RNA在膠上的遷移性

DNA或RNA分子帶有負(fù)電荷，在膠支