第六章 化學物質與蛋白質的相互作用1-2節(jié)

第六章

化學物質與蛋白質的相互作用

Interactionsbetweenchemicalsandproteins

主要內容第一節(jié)化學物質對蛋白質的沉淀作用

Precipitationofproteinsbychemicals第二節(jié)化學物質對蛋白質的穩(wěn)定作用

Stabilizationofproteinsbychemicals第三節(jié)化學物質對蛋白質側鏈基團的共價修飾作用

Covalentmodificationofproteinside-chaingroupsbychemicals第四節(jié)蛋白質光譜探針

Spectroscopicprobeofproteins教學要求熟練掌握化學物質對蛋白質的沉淀作用、變性作用和穩(wěn)定作用；掌握化學物質對蛋白質側鏈基團的共價修飾作用；掌握蛋白質吸光光度、熒光等分子光譜探針對蛋白質定量分析。在生物體內，蛋白質（包括酶）占細胞干重的70%以上，種類繁多，在生命活動過程中起著發(fā)揮各種各樣的作用。隨著人們對環(huán)境保護和生活質量要求的提高，蛋白質在食品、醫(yī)藥（生化藥物、臨床檢驗、藥物篩選等）、環(huán)保（環(huán)境分析）、農(nóng)業(yè)、日用化工（化妝品）、精細化工（酶催化合成）等領域的應用日益廣泛。在蛋白質體外的應用中，一般涉及到分離純化、儲存、含量檢測等過程，其中常常發(fā)生化學物質與蛋白質非專一性的相互作用，如沉淀作用、變性作用、穩(wěn)定作用以及化學修飾作用等。

化學物質與蛋白質的相互作用球狀蛋白三級結構的主要特征絕大多數(shù)的蛋白質折疊成為近乎球狀的結構。球狀蛋白質一旦具有三級結構后，蛋白質內部變得更為緊密，內部的空間約有75％被原子所充滿。這樣的密集程度遠遠超過在液體中的小分子，可以與一些晶體的情況相比?？梢哉J為蛋白質是帶有極性外套的油滴，也就是“非極性在內，極性在外”。大量蛋白質的X射線晶體衍射分析統(tǒng)計的結果充分證明了這一規(guī)律。蛋白質內部主要是一些非極性殘基的側鏈在分子內部約有63％是丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等帶電的殘基，天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸只有4％。約95％的帶電的側鏈是分布在蛋白質的表面；約14％的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸在蛋白質分子表面。在蛋白質的內部也存在極少量的親水殘基，在蛋白質分子的表面也常見到一些疏水的殘基。這些“異?！狈植嫉臍埢率闺逆湹木植拷Y構發(fā)生“扭曲”，一些鍵的張角與一般正常的值有所偏離，蛋白質中這些局部的構象具有相對偏高的能量，相對地處于較不穩(wěn)定的狀態(tài)，在外界很小的擾動作用下，就能發(fā)生變化。原則上，一些相對規(guī)則的

-螺旋和

-折疊分布在球狀蛋白的內部，而且壓積得很緊密，致使球狀蛋白成為致密的結構；那些連接

-螺旋和

-折疊的規(guī)整性相對差一些的二級結構，轉角和環(huán)狀以及特定的“無規(guī)”卷曲，則更多地是分布在球狀蛋白的外周。還值得指出的是，在很多蛋白質分子的內部還存在著數(shù)量不同的水分子，這些水分子也和一些極性的基因或負電性的原子形成氫鍵。其中一些水分子也參與了蛋白質功能的行使。球狀蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多溝渠，多數(shù)球狀蛋白的可及表面的面積約為同樣大小的球的表面積的兩倍。

球狀蛋白二級結構的特征具有高度特異性和高度靈敏性。每種蛋白質分子都有特定的高級結構。這種構象的特異性，使它區(qū)別于其它類蛋白質；但這種高度特異的結構，并非固定不變，在執(zhí)行生物學功能時，常常發(fā)生一系列的構象變化，表現(xiàn)出高度靈敏性。球狀蛋白質分子的立體結構在生物體內，這些構象變化，往往是該蛋白質分子與配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受體的小分子激素和神經(jīng)介質、血紅蛋白的O2等。因此，生物體內的蛋白質是處于一種可以相互轉變的多種構象的平衡態(tài)；球狀蛋白質分子表面并不是光滑的，經(jīng)常會出現(xiàn)一些“裂隙”或“洞穴”，在“裂隙”或“洞穴’’的周圍常常是疏水性的：這些“裂隙”或“洞穴”可能是蛋白質(酶)的活性部位所在。化學物質的作用與蛋白質分子的構象硫氧還蛋白的結構緊密結合水親水性殘基疏水性殘基第一節(jié)

化學物質對蛋白質的沉淀作用

Precipitationofproteinsbychemicals蛋白質的膠體性質

蛋白質的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質溶液具有膠體溶液的典型性質，如丁達爾現(xiàn)象、布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。根據(jù)蛋白質的親水膠體性質，當其環(huán)境發(fā)生改變時，蛋白質會發(fā)生沉淀作用。蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。改變溶液的條件，將影響蛋白質的溶解性質。在適當?shù)臈l件下，蛋白質能夠從溶液中沉淀出來。

沉淀作用的類型可逆沉淀不可逆沉淀抗體-抗原沉淀在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。蛋白質在沉淀過程中結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，又稱為非變性沉淀。在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產(chǎn)生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，又稱為變性沉淀。抗體和抗原蛋白通過相互識別和結合而發(fā)生的沉淀現(xiàn)象。這種特殊的沉淀作用是生物體免疫功能的基礎。一、無機物沉淀二、沉淀劑的類型有機物沉淀鹽析金屬離子沉淀法等電點沉淀聚合物沉淀蛋白質水中的溶解度與其表面性質有關在水溶液中，蛋白質分子表面帶有電荷基團：天冬氨酸、谷氨酸殘基（含羧基）、組氨酸、精氨酸、賴氨酸殘基（含氨基）；含有疏水基團形成區(qū)域：苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、纈氨酸等的側鏈，在疏水區(qū)域的周圍，水分子呈有序排列。1、無機物沉淀（1）鹽析牢固結合水大量溶劑水層當向蛋白質溶液中逐漸加入無機鹽時，開始，蛋白質的溶解增大，這是由于蛋白質的活度系數(shù)降低的緣故，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。但當繼續(xù)加入電解質時，另一種因素起作用，使蛋白質的溶解度減小，稱為鹽析。這是由于電解質的離子在水中發(fā)生水化，當電解質的濃度增加時，水分子就離開蛋白質的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質聚集而沉淀，疏水區(qū)域越多，就越易產(chǎn)生沉淀。MelanderandHorvath理論分析蛋白質的鹽析作用是由于靜電作用引起的鹽溶和疏水作用引起的鹽析這兩種作用相互作用的結果，鹽析方程表示為lgS=lgS0-KsIS0代表當離子強度為零時的溶解度，S為蛋白質在某一離子強度溶液中的溶解度；I為中性鹽的離子強度；Ks為鹽析常數(shù)。對于蛋白質組成相近的蛋白質，分子量越大，沉淀所需鹽的量越少蛋白質分子不對稱性越大，越易沉淀。不同種類的鹽對溶解度的影響與Ks值有關：Ks值較大，該鹽的鹽析效果好。含高價陰離子的鹽，效果比1價的鹽好。陰離子的鹽析效果有下列次序：檸檬酸鹽>PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-

但高價陽離子的效果不如低價陽離子，例如硫酸鎂的效果不如硫酸銨。對于1價陽離子則有下列次序：

NH4+＞K+＞Na+最常用的鹽析劑是硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀或磷酸鈉。但硫酸鈉在40C

以下溶解度較低，因而僅適用于對熱穩(wěn)定的蛋白質。磷酸鹽在中性范圍內實際上是HPO42-和H2PO4-的混合物，其作用比PO43+差。硫酸銨由于價廉、溶解度大，且能使蛋白質穩(wěn)定,在2-3mol/L(NH4)2SO4中酶可保存幾年。同時由于鹽的濃度高，可防止蛋白酶和細菌作用，故是最常用的鹽析劑。硫酸銨的缺點是水解后變酸，在高pH下會釋放出氨，腐蝕性強；殘留的硫酸銨在食品中雖然量少，也會影響其味，在醫(yī)療上有毒，因此必須除去。常用的鹽析劑一些高價金屬離子對沉淀蛋白質很有效。它們可以分為三類：第一類為Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和Cd2+能和蛋白質分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等側鏈結合。第二類為Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+能和蛋白質分子表面的羧基結合，但不和含氮化合物相結合。第三類為Ag+，Hg2+和Pb2+能和蛋白質分子表面的巰基相結合。（2）金屬離子沉淀法在稀溶液中金屬離子對蛋白質有效強的沉淀能力。處理后殘余的金屬離子可用離子交換樹脂或螯合劑除去。在這些離子中，應用較廣的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和Mn2+，而Cu2+，F(xiàn)e2+，Pb2+，Hg2+等較少應用，因為它們會使產(chǎn)品損失和引起污染。如Zn2+可用于沉淀桿菌肽(作用于第4個組氨酸殘基上)和胰島素；Ca2+(CaCO3)用于分離乳酸，血清清蛋白等。金屬離子沉淀法的優(yōu)點返回2、等電點沉淀蛋白質與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時，蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。等電點沉淀法的一個主要優(yōu)點是很多蛋白質的等電點都在偏酸性范圍內，而無機酸通常價較廉，并且某些酸，如磷酸、鹽酸和硫酸的應用能為蛋白質類食品所允許。同時，?？芍苯舆M行其他純化操作，無需將殘余的酸除去。等電點沉淀法的最主要缺點是酸化時，易使蛋白質失活，這是由于蛋白質對低pH比較敏感。pH對

-乳球蛋白溶解度的影響

返回3、有機物沉淀有機溶劑酚類化合物及有機酸沉淀（1）有機溶劑利用和水互溶的有機溶劑使蛋白質沉淀的方法很早就用來純化蛋白質。加入有機溶劑于蛋白質溶液中產(chǎn)生多種效應，這些效應結合起來使蛋白質沉淀。其中主要效應是水活度的降低。當有機溶劑濃度增大時，水對蛋白質分子表面上荷電基團或親水基團的水化程度降低，或者說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸力增大。在疏水區(qū)域附近有序排列的水分子可以為有機溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了疏水性特別強的蛋白質外，對多數(shù)蛋白質來說，后者影響較小，所以總的效果是導致蛋白質分子聚集而沉淀。

有機溶劑容易蒸發(fā)除去，不會殘留在成品中，因此適用于制備食品蛋白質。而且有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。有機溶劑沉淀法的缺點是容易使蛋白質變性失活，且有機溶劑易燃、易爆、安全要求較高。一般所選擇的溶劑必須能和水互溶，而和蛋白質不發(fā)生化學反應，最常用的溶劑是乙醇和丙酮，加量在20%-50%（V/V））之間。當?shù)鞍踪|的溶液pH接近等電點時，引起沉淀所需加入有機溶劑的量較少。

有機溶劑沉淀法的優(yōu)缺點（2）酚類化合物及有機酸沉淀當?shù)鞍踪|溶液pH小于其等電點時，蛋白質顆粒帶有正電荷，容易與酚類化合物或有機酸酸根所帶的負電荷發(fā)生作用生成不溶性鹽而沉淀。這類化合物包括鞣酸（又稱單寧）、苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水楊酸等。一種多酚類化合物的寡聚體，它們的酚羥基可以解離而帶有負電荷，而且分子中的苯環(huán)、多個羥基可以與蛋白質發(fā)生非共價相互作用，結合在蛋白質的表面。單寧單寧與蛋白質的相互作用模型在蛋白質分子之間形成多點交連而成網(wǎng)絡結構，最終導致聚集而沉淀。4、聚合物沉淀非離子型聚合物沉淀法聚電解質沉淀法（1）非離子型聚合物沉淀法許多非離子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用來進行選