鼠疫間接血凝試驗和反相血凝試驗

間接血凝試驗和反相血凝試驗

祁騰

四川省疾病預(yù)防控制中心11、鼠疫血清學(xué)檢驗的發(fā)展過程1.1二十世紀初鼠疫的診斷主要靠分離病原菌鼠疫菌多在動物鼠疫流行時才可分離到，某些因素如被檢材料的腐敗程度，鼠疫病人取材前用過抗菌素，鼠疫菌的毒力等都不同程度地影響鼠疫菌的分離。僅靠分離鼠疫菌的方法對鼠疫病人診斷、進行病原檢索、動物鼠疫調(diào)查等已不能解決問題。后來，發(fā)展了細菌凝集和熱沉淀反應(yīng)測定鼠疫抗體或抗原，但由于這些反應(yīng)特異性差，敏感性低，只能作為輔助診斷方法之一21.2二十世紀50年代以后

Baker提取出了具有特異性的鼠疫菌FI抗原利用鼠疫菌FI抗原或特異性抗體吸附于顆粒性載體（血球、乳膠、炭顆粒等），形成間接血凝試驗技術(shù)后來，用單寧酸處理紅血球，再吸附FI抗原，提高了敏感性和特異性，WHO（1956）推薦列為鼠疫診斷常規(guī)方法之一31.3二十世紀70年代初鼠疫間接血凝技術(shù)在我國得到推廣，并大規(guī)模用于實踐之后用于檢查抗原的鼠疫反向血凝試驗，也陸續(xù)出現(xiàn)我國制備的鼠疫抗體致敏血球可檢查2.4萬個菌/ml，其特異性和敏感性可與WHO提供的制劑相媲美，已在國內(nèi)廣泛應(yīng)用42.1血清學(xué)檢測是依據(jù)抗原或抗體與其相對應(yīng)的特異抗體或抗原在一定條件下（如適宜的反應(yīng)介質(zhì)和溫度）可發(fā)生免疫化學(xué)反應(yīng)，生成特異的抗原—抗體復(fù)合物。主要有直接凝集和間接凝集2、血清學(xué)檢測的原理52.1.1直接凝集

顆粒性的抗原與相應(yīng)的抗體反應(yīng)時，抗原與抗體結(jié)合并逐步形成肉眼可見的大凝集塊的反應(yīng)2.1.2間接凝集

水容性抗原與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)時，形成抗原-抗體復(fù)合物，是肉眼不可見的，需加入相應(yīng)的載體，借助載體的凝集出現(xiàn)可見反應(yīng)63、間接紅血球凝集試驗（IHA）3.1間接凝集反應(yīng)以紅細胞作為載體，當(dāng)紅細胞表面吸附了可溶性抗原時，稱為致敏的紅細胞，它與相應(yīng)抗體發(fā)生凝集，稱為間接紅血球凝集試驗(IHA)，它是一種敏感性高、特異性強的血清學(xué)診斷方法3.2由于紅細胞被動地凝集在一起，故又稱為被動血凝試驗（PHA)73.3間接血凝實驗的特點3.3.1敏感性高，可檢測出微量抗原3.3.2時間短、快速：在2h內(nèi)可出結(jié)果3.3.3特異性好：FI抗原抗體反應(yīng)特異性高，與假結(jié)核血清出現(xiàn)交叉反應(yīng)不超過1：5；診斷制劑制作簡單、穩(wěn)定3.3.4抗原（抗體）致敏血球可冷藏保存1-2年，敏感性和特異性不受影響83.4間接血球凝集試驗多用于3.4.1疑似鼠疫患者的診斷和追溯診斷3.4.2開展動物鼠疫流行調(diào)查和流行規(guī)律的調(diào)查3.4.3用于實驗研究，觀察抗體的產(chǎn)生3.4.4對鼠疫菌苗和菌苗免疫效果進行評價等方面

94、間接血球凝集抑制試驗

4.1初篩陽性的血清經(jīng)二倍系列稀釋后，在每個稀釋孔加入一定量的鼠疫F1抗原，進行中和后。再加入吸附鼠疫F1抗原的紅血球，觀察是否還出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，這一方法稱間接血凝抑制試驗

4.2如沒有出現(xiàn)血球凝集現(xiàn)象，可以說明血清中的抗體是鼠疫F1抗體，因為加入的抗原是已知的FI特異抗原，這一結(jié)果稱間接血凝抑制試驗陽性

105、反向血球凝集試驗5.1反向血球凝集試驗是相對于間接血球凝集試驗而言。將已知鼠疫FI抗體吸附在綿羊血球上，按相同的方法操作，檢測樣品中的鼠疫FI抗原是否存在，此方法稱為反向血球凝集試驗。其操作、凝集相及判定標準與間接血球凝集試驗完全相同5.2反向血凝試驗多用于：分離鼠疫菌困難的情況下；對疑似鼠疫病人的診斷、動物鼠疫的判定

116、反向血球凝集抑制試驗6.1與間接血球凝集抑制試驗的原理相同其方法是用被檢材料浸出液二倍系列稀釋，每孔先加入高效價鼠疫診斷血清（鼠疫F1抗體）進行中和，再加入吸附鼠疫F1抗體的紅血球，觀察是否還出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。這一方法稱反向血凝抑制試驗6.2如果沒有出現(xiàn)原來陽性的凝集相或從某一稀釋度之后出現(xiàn)陰性結(jié)果，為反向血凝抑制試驗陽性127、鼠疫血清學(xué)檢測方法137.1間接血球凝集試驗(IHA)的

操作方法147.1.1實驗用品的準備與處理7.1.1.1玻璃器皿如新購置玻璃器皿，應(yīng)以2%HCl浸泡2小時，以除去游離堿，清洗干凈后干烤滅菌方可使用。每次試驗后應(yīng)放入消毒液中浸泡12-24小時后，清洗干凈，再用自來水和蒸餾水沖洗，干烤或涼干后使用7.1.1.2一次性用品

一次性微量血凝板，吸頭等要一次性使用，不要重復(fù)用7.1.1.3高值用品

加樣器、離心機等儀器、設(shè)備，要愛護，定期對準確性進行檢測151617187.1.2.1試劑1）鼠疫F1抗原致敏血球抗原致敏血球為戊二醛固化并經(jīng)單寧酸處理的羊血球，再以33%飽和度硫酸銨兩次鹽析提純的FI抗原致敏。用于間接血凝試驗的抗原致敏血球應(yīng)定期進行試劑質(zhì)量檢測，并符合以下標準a)用細菌凝集效價為1∶320的鼠疫全菌免疫血清，血凝滴度應(yīng)不低于1∶40000b)與假結(jié)核血清交叉滴度應(yīng)不高于1∶52）單寧酸血球

與鼠疫F1抗原致敏血球同一批次的單寧酸血球3）稀釋液含1%正常兔血清的生理鹽水4）抑制劑含50ug/mL～100ug/mL鼠疫F1抗原的稀釋液5）陽性參考血清7.1.2間接血凝試驗：測定鼠疫抗體197.1.2.2標本的準備血清標本應(yīng)經(jīng)56℃30分鐘滅活，4℃保存、待檢，如需長期保存則加入疊氮鈉（終濃度為0.1%)或1%硫柳汞（終濃度為1/5000--1/10000）

20217.1.2.3操作步驟7.1.2.3.1初篩試驗操作步驟1）每份被檢血清在V型孔微量血凝板稀釋5孔2）用移液器向每孔分別加入25μL稀釋液3）在第1孔中加入被檢血清25μL，吸排4～6次，充分混勻后，取25μL移至第2孔，充分混勻，依次稀釋至最后一孔，棄掉25μL4）分別在各孔內(nèi)加入1%鼠疫F1抗原致敏血球25μL，振蕩混勻。置37℃溫箱或室溫2h后觀察結(jié)果227.1.2.3.2結(jié)果判定1）“?！保耗蜾仢M孔底，有明顯折邊，抗體過量時，凝集呈疏松花圈狀

2）“＋＋＋”：凝集血球鋪滿孔底，無折邊3）“＋＋”：血球不完全凝集，在孔底呈整齊的圓圈，但圈內(nèi)外有非常明顯的血球凝集

4）“＋”：在孔底形成較小的圓圈，在圈內(nèi)外只有很少的血球凝集5）“–”：血球全部沉積在V型孔的底部，呈整齊的小珠狀

呈現(xiàn)“++”以上的凝集現(xiàn)象時，進行以下復(fù)判操作

2324257.1.2.3.3復(fù)判操作步驟1）每份初篩陽性的血清在V型孔微量血凝板稀釋兩列，第一列為血凝抑制試驗列，第二列為血凝試驗列2）用移液器向第一列每孔內(nèi)加抑制劑25μL，向第二列每孔內(nèi)加稀釋劑25μL3）用移液器分別取被檢血清25μL加入各列的第一孔內(nèi)，吸排混勻4～6次,，再吸取25μL加入相應(yīng)列的第二孔內(nèi)，混勻。依此類推稀釋至最后一孔，吸出25μL棄入消毒液中。置37℃溫箱10min～15min4）在第一、二列各孔中，用移液器加入稀釋至1%的鼠疫F1抗原致敏血球懸液25μL。震蕩混勻，置37℃2小時后觀察結(jié)果。至此，每列第1孔的稀釋度為1：426

5）每組同時設(shè)下列對照

a）空白對照：稀釋液25μL+1%鼠疫F1抗原致敏血球25μLb）陰性對照：1：20被檢血清25μL+1%單寧酸血球25μLc）陽性對照：稀釋的陽性參考血清＋1%鼠疫F1抗原致敏血球25μL6）結(jié)果判定方法同7.1.2.3.2

空白對照、陰性對照孔不應(yīng)呈現(xiàn)凝集，陽性對照成立。最終結(jié)果，當(dāng)血凝抑制列呈“++”凝集的孔比血凝試驗列少2孔以上，判定為特異性凝集。陽性血清最終效價為凝集排呈現(xiàn)“++”的最高稀釋度27287.1.3反向間接血球凝集試驗（RIHA）：測定鼠疫菌FI抗原7.1.3.1試劑1）鼠疫FI抗體致敏血球

2）抑制劑為1：100稀釋的鼠疫免疫血清3）陽性對照血清：陰性混合血清加F1抗原至1mg/mL，1：100稀釋后作為陽性對照

297.1.3.2準備標本待查患者可采取血清、淋巴穿刺液、咽拭子浸出液、腦脊液等液體標本，也可采取血塊等組織標本。尸檢則采取各有關(guān)的組織標本。將組織標本在滅菌容器中制成懸液，加9倍組體積的稀釋液（加5%甲醛）混懸，靜置，取上清液作為1：10標本307.1.3.3操作步驟7.1.3.3.1初篩試驗操作步驟1）每份被檢液在V型孔微量血凝板稀釋5孔2）用移液器向每孔分別加入25μL稀釋液3）在第1孔中加入被檢液25μL，吸排4～6次，充分混勻后，取25μL移至第2孔，充分混勻，依次稀釋至最后一孔，棄掉25μL4）分別在各孔內(nèi)加入1%鼠疫F1抗體致敏血球25μL，振蕩混勻。置37℃溫箱或室溫2h后觀察結(jié)果7.1.3.3.2結(jié)果判定:方法同間接血凝初篩試驗（7.1.2.3.2）317.1.3.3.1復(fù)判操作步驟1）每份初篩陽性的被檢材料在V型孔微量血凝板做二列復(fù)判試驗，第一列為抑制列，第二列為凝集列2）用移液器向抑制列每孔加入25μL抑制劑，向凝集列每孔加25μL稀釋液3）分別向每列第1孔中加入被檢液25μL，兩列分別進行倍比稀釋，方法同7.1.2.3.3中3），至每列最后一孔棄25μL,室溫作用15min4）各孔內(nèi)加入1%鼠疫F1抗體致敏血球25μL，振蕩混勻，置37℃溫箱或室溫2h后觀察結(jié)果

325）設(shè)置對照：a）空白對照：稀釋液25μL+1%鼠疫F1抗體致敏血球25μLb）陰性對照：被檢液25μL+1%單寧酸血球25μLc）陽性對照：陽性對照血清+1%鼠疫F1抗體致敏血球25μL6）結(jié)果判定:方法同間接血凝（7.1.2.3.2

）

最終結(jié)果，空白對照、陰性對照孔不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，陽性對照成立。當(dāng)抑制列呈“++”凝集的孔比試驗列少2孔以上，判定為特異性凝集陽性最終效價為凝集排呈現(xiàn)“++”的最高稀釋度337.1.4血凝試驗結(jié)果的分析和判定1）抑制列－－－－－對照－血凝列#+++

++

+－結(jié)果：陽性，滴度（++）2）抑制列－－－－－－對照－血凝列+－－－－－

結(jié)果：陰性3）抑制列#++

－－－－－－血凝列###+++++++++－對照－

結(jié)果：陽性，滴度（++）4）抑制列++++++++

血凝列++++++++對照++

非特異性凝集347.1.5鼠疫血清學(xué)陽性結(jié)果判定1）IHA1:16（++）以上；RIHA1:100（++）2）雙份血清（間隔10天）用IHA法檢測FI抗體，呈4倍以上增長357.1.6血凝試驗的有關(guān)注意事項7.1.6.1試驗用器材、量具要準確、清洗要干凈；使用過的，要洗凈后再用蒸餾水沖洗1—2次，防止殘留的消毒液、洗液及陽性材料造成假陽性。最好能干烤或高壓處理，不能干烤或高壓的可重復(fù)使用的器材用0.2%稀鹽酸浸泡2小時以上處理。7.1.6.2微量血凝試驗要使用一次性的“V”型微量血凝板。使用移液器加試劑。吸頭也要使用一次性的，應(yīng)與移液器配套。滴加各種試劑要準確，防止交叉污染。使用的用具、每次稀釋后棄掉的25ul液