熒光定量 PCR 要點(diǎn)解析

熒光定量PCR要點(diǎn)解析熒光定量PCR(Real-timePCR)，是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過對擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時檢測，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。以探針法熒光定量PCR為例：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。開始時，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴(kuò)增時，Taq酶將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。傳統(tǒng)的PCR進(jìn)行檢測時，擴(kuò)增反應(yīng)后需要進(jìn)行染色處理及電泳分離，并且只能作定性分析，不能準(zhǔn)確定量，易造成污染出現(xiàn)假陽性，使其應(yīng)用受到限制。實(shí)時定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對模板的定量，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好自動化程度高和無污染的特點(diǎn)，使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動生成也可以手動設(shè)置的。之后反應(yīng)會進(jìn)入指

數(shù)增長期，這個期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性，在該期間，可設(shè)定一條熒光閾值線，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般會將熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值，這個值與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，且該值具有重現(xiàn)性。otil153tCycles數(shù)增長期，這個期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性，在該期間，可設(shè)定一條熒光閾值線，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般會將熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值，這個值與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，且該值具有重現(xiàn)性。otil153tCyclescr平臺期星線期指數(shù)增反期基線閾值線Ct值最大的意義就是用來計算目的基因的表達(dá)量，此時就有兩個概念容易被提及，那就是絕對定量和相對定量，絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。Ct值誠然可以被利用來計算這兩種定量結(jié)果，但是絕對定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。絕對標(biāo)準(zhǔn)品制作困難難以獲取，實(shí)驗(yàn)室基本都是選擇相對定量的方法來行梳理。常規(guī)熒光定量PCR的流程是：樣品采集-運(yùn)輸-樣品處理-核酸提取-反轉(zhuǎn)錄（RNA病毒）-擴(kuò)增-結(jié)果讀取。下面看看各個環(huán)節(jié)都可以使用哪些對照？1、陽性對照和陰性對照陽性對照和陰性對照是指在相同的處理條件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進(jìn)行了提取和擴(kuò)增最終獲得了陽性結(jié)果和陰性結(jié)果。陰陽性對照強(qiáng)調(diào)處理過程與樣品一致，并且有明確的預(yù)期結(jié)果。2、擴(kuò)增對照我們通常說的陽性對照和陰性對照指的是擴(kuò)增試劑盒中附帶的不需要提取的陽性對照和陰性對照，更準(zhǔn)確的定義應(yīng)該是擴(kuò)增陽性對照和擴(kuò)增陰性對照。擴(kuò)增陽性對照含有陽性擴(kuò)增模板，擴(kuò)增陰性對照應(yīng)含有陰性擴(kuò)增模板（基質(zhì)核酸）。擴(kuò)增對照只能監(jiān)控每次擴(kuò)增過程中的擴(kuò)增系統(tǒng)是否正常，不能監(jiān)控采樣、提取和每份樣品的操作過程。如果是檢測RNA樣品的檢測試劑盒，其擴(kuò)增陽性對照使用質(zhì)粒便無法監(jiān)控反轉(zhuǎn)錄過程。3、內(nèi)標(biāo)(InternalControl，IC)內(nèi)標(biāo)是指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子。內(nèi)標(biāo)有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo)，另一種是人工添加的內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)的最大特點(diǎn)是與靶序列共同擴(kuò)增，而其他的對照都是獨(dú)立擴(kuò)增。內(nèi)參基因通常它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測基因的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。內(nèi)參基因通常是持家基因(house-keepinggene)因?yàn)槠浔磉_(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，而且在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)變化很小。常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、B-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。內(nèi)參基因的優(yōu)點(diǎn)是與樣品中的靶基因經(jīng)歷完全相同的處理程序，可以監(jiān)控采樣運(yùn)輸，核酸提取和擴(kuò)增的全部過程。缺點(diǎn)是不同物種，不同生理狀態(tài)下，不同組織中的內(nèi)參基因存在一定的差異。如果樣品類型是口腔液，咽拭子等樣品，內(nèi)參基因的量很低可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成立。如果檢測的是環(huán)境樣品則內(nèi)參基因可能完全失效。人工內(nèi)標(biāo)添加一種不會干擾靶序列擴(kuò)增的人工合成的內(nèi)標(biāo)?，F(xiàn)在國外的診斷試劑盒大部分都會將內(nèi)標(biāo)直接添加在反應(yīng)液中與模板一起擴(kuò)增，但是這樣的內(nèi)標(biāo)不能監(jiān)控采樣運(yùn)輸和核酸提取的過程。還有另一種形式的內(nèi)標(biāo)，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內(nèi)標(biāo)，這樣就可以監(jiān)控樣品的提取到擴(kuò)增的過程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監(jiān)控胞內(nèi)細(xì)菌病毒的釋放情況。4、核酸提取對照可以使用內(nèi)參基因，假病毒混合基質(zhì)，滅活病毒混合基質(zhì)來監(jiān)控提取到擴(kuò)增的流程。5、反轉(zhuǎn)錄對照(RTcontrol)可以使用提取好的RNA內(nèi)參基因，RNA假病毒混合基質(zhì)，滅活RNA病毒混合基質(zhì)來監(jiān)控反轉(zhuǎn)錄到擴(kuò)增的流程。無反轉(zhuǎn)錄對照（no-RTcontrol）含有除反轉(zhuǎn)錄酶以外的所有成分。6、空白對照（Blankcontrol）（1）無模板空白對照NTC是指不含有模板（陽性模板或者陰性模板）的對照。目前的試劑盒的NC一般都是水或陰性緩沖液，所以NC等同于NTC。其實(shí)兩者有不同的作用。（2）儀器空白對照NTC是含有引物探針和反應(yīng)液主要監(jiān)控引物探針，反應(yīng)體系有沒有被污染。這里的儀器空白對照我通常使用的是空反應(yīng)管來監(jiān)控儀器有無非特異性的熒光信號。（3）熒光染料對照最常使用的是ROX染料，由于熒光定量PCR的熒光信號在每個樣品孔會有微小的差異所以使用特定的ROX熒光染料，系統(tǒng)可以根據(jù)ROX熒光染料的信號值來校準(zhǔn)每孔的熒光信號。7、質(zhì)控品（Qualitycontrol,QC）上述環(huán)節(jié)中使用的各種對照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產(chǎn)品，有的是實(shí)驗(yàn)室自制，所以整個的監(jiān)控過程可能存在不夠客觀和獨(dú)立。因此在實(shí)驗(yàn)室的對照設(shè)置中每次檢測都建議使用第三方質(zhì)控品，有條件的使用國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Referencematerial,RM）。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確量值和計量溯源性，可以更準(zhǔn)確的評估整個試驗(yàn)流程的準(zhǔn)確度。8、定值參考品醫(yī)學(xué)上的定量檢測試劑盒，需要配套定值參考品用于試劑盒的定量檢測使用。對照的選擇從上文可知沒有一種對照是完美的，在檢測中我們要根據(jù)自己的需求來進(jìn)行靈活選擇和搭配。筆者建議每一次檢測時添加一個能對從提取到擴(kuò)增環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控的質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；每份檢測樣品中添加內(nèi)標(biāo)（如果樣品種類比較多樣建議使用人工內(nèi)標(biāo)，如果樣品類型為相對固定的動物組織建議使用內(nèi)參基因）；擴(kuò)增陽性對照，擴(kuò)增陰性對照，無模板對照和ROX對照。有條件的添加臨床陽性對照和臨床陰性對照，在懷疑提取環(huán)節(jié)或者反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題時使用核酸提取對照和反轉(zhuǎn)錄對照不定期使用儀器空白對照。陽性對照與污染不可否認(rèn)的一個事實(shí)是陽性對照可以增加實(shí)驗(yàn)室污染的風(fēng)險。這種污染的來源一種是直接來源于擴(kuò)增陽性對照的污染。對于擴(kuò)增陽性對照來說通常10000拷貝/微升（CT值約25）是比較理想的，但是有一些試劑盒廠家的擴(kuò)增陽性對照設(shè)置在CT值20以下，比大部分陽性樣本都強(qiáng)。這么高濃度的對照給實(shí)驗(yàn)室?guī)砹司薮蟮奈廴撅L(fēng)險，原因可能僅僅是因?yàn)樵噭S家擔(dān)心其陽性對照不穩(wěn)定，長時間存放陽性對照降解。另一種污染來自于擴(kuò)增產(chǎn)物的處理不當(dāng)，或者實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計布局不合理。初篩和確診對照與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡年P(guān)系好像從來沒有人提及過。根據(jù)筆者多年在檢測實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，分享一點(diǎn)個人的心得，歡迎大家批評指正。對于初篩實(shí)驗(yàn)，我們希望提高真陽性檢出率，即提高診斷敏感性。我們需要檢測系統(tǒng)達(dá)到最高檢測效率，因此要在不同環(huán)節(jié)添加陽性對照，確保每個環(huán)節(jié)的檢測效率最高。對于確診實(shí)驗(yàn)，我們希望提高真陰性檢出率，即提高診斷特異性。我們需要確保檢測系統(tǒng)不出現(xiàn)假陽性，因此要在不同環(huán)節(jié)添加陰性對照，減少非必須的陽性對照，甚至要在樣品盤的不同位置中隨機(jī)插入幾個陰性對照，確保實(shí)驗(yàn)過程中沒有被污染。分子生物學(xué)研究1、核酸定量分析：對傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測，比如近期流行的甲型H1N1流感，轉(zhuǎn)基因動植物基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。2、基因表達(dá)差異分析：比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異（如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等），特定基因在不同時相的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證3、SNP檢測：檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的SNP檢測將會變得簡單而準(zhǔn)確4、甲基化檢測：甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥，Laird報道了一種稱作Methylight的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理DNA，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和Taqman探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。醫(yī)學(xué)研究1、產(chǎn)前診斷：人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，到目前為止，還只能只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA,用實(shí)時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。2、病原體檢測：采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)。3、藥物療效考核：對乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。4、腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機(jī)理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實(shí)時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測癌基因的表達(dá)量。目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測。其它：如分析失敗，將對同一原始樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。如仍不能發(fā)出報告者，分析原因并告知受檢者重新采樣檢驗(yàn)。相關(guān)文件10.1采樣管理程序10.2標(biāo)本管理程序相關(guān)記錄末梢血采集作業(yè)指導(dǎo)書1.目的采集末梢血標(biāo)本以做門診血常規(guī)檢驗(yàn)。2.適用范圍適用于門診檢驗(yàn)科做血常規(guī)等項目所需血液標(biāo)本的采集。物品準(zhǔn)備：一次性采血針、75%酒精、無菌棉球、0.5毫升離心管（EDTAK2抗凝管）、試管架、編號筆、微型震蕩器、口罩。檢驗(yàn)申請單填寫要求：檢驗(yàn)申請單用鋼筆填寫，使用正楷字，字跡清楚，填寫完整。填寫內(nèi)容包括：受檢者姓名、性別、年齡、化驗(yàn)單編號、臨床診斷、送檢標(biāo)本、檢驗(yàn)項目、標(biāo)本采集標(biāo)本年月日時、申請醫(yī)生及采樣者簽名。5.操作步驟：查對檢驗(yàn)申請單、受檢者姓名及是否已按醫(yī)囑準(zhǔn)備，向受檢者解釋操作目的，以取得合作。常用選擇無名指，先用酒精棉球消毒，然后用一次性采血針穿刺，讓血液自然流出，用消毒棉球輕拭去第一滴后，將血液收集在0.5毫升離心管（EDTAK2抗凝管），約0.2-0.3毫升。用干棉球壓住穿刺部位，囑采血對象按壓2-3分鐘。在微型震蕩器混勻。馬上送檢。6.注意事項采血前應(yīng)核對好姓名和檢驗(yàn)項目，明確標(biāo)本要求。血常規(guī)用EDTAK2抗凝管收集血標(biāo)本后，在微型震蕩器混勻，使血液與抗凝劑充分混勻。除特殊情況外，不要在耳垂采血。嬰幼兒可自拇指或足跟兩側(cè)采血。燒傷患者可根據(jù)情況選用皮膚完整的肢體末端。采血部位應(yīng)無炎癥或水腫。末梢采血不可用力擠壓。標(biāo)本運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)前存放：立即送檢，如需保存，可置2-8C存放不超過8小時。其它：如分析失敗，將對同一原始樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。如仍不能發(fā)出報告者分析原因并告知受檢者重新采樣檢驗(yàn)。9.相關(guān)文件采樣管理程序標(biāo)本管理程序10.相關(guān)記錄動脈血液采集作業(yè)指導(dǎo)書1.目的抽取動脈血標(biāo)本，主要用做血?dú)夥治觥?.適用范圍適用于血?dú)夥治鏊柩簶?biāo)本的采集。物品準(zhǔn)備：止血帶、一次性墊巾、無菌棉簽、復(fù)合碘消毒液、注射器（數(shù)量和種類根據(jù)要求選取后檢查滅菌日期、有效期及有無漏氣）、試管架、編號筆、口罩。檢驗(yàn)申請單填寫要求：檢驗(yàn)申請單用鋼筆填寫，使用正楷字，字跡清楚，填寫完整。填寫內(nèi)容包括：受檢者姓名、性別、年齡、臨床診斷、送檢標(biāo)本、檢驗(yàn)項目、用藥情況、抽血時的體溫、是否用氧及其流量、標(biāo)本采集年月日時、申請醫(yī)生及采樣者簽名。5.操作步驟：查對檢驗(yàn)申請單、受檢者姓名及是否已按醫(yī)囑準(zhǔn)備，向受檢者解釋操作目的，以取得合作。5.2采血時用2-5mL干燥注射器,按無菌手續(xù)抽取肝素抗凝素（1mL=1000U,生理鹽水配制）0.2mL,來回抽動針?biāo)?，使針管全部濕潤，將多余的肝素排出。選擇血管,常用股動脈、肱動脈或橈動脈。用復(fù)合碘棉簽消毒穿刺部位。選擇動脈搏動最強(qiáng)處穿刺。穿刺旋緊持針器上的針頭，摘掉穿刺針上的保護(hù)套，試穿刺針是否通暢。5.6.2進(jìn)行動脈穿刺，穿刺成功后，采集動脈血2mL，用棉簽壓住進(jìn)針處，拔出針頭，囑采血對象按壓2-3分鐘。抽出后立即用一橡皮頭封閉針頭，隔絕空氣，將注射器重于手中反復(fù)旋轉(zhuǎn)搓動即達(dá)抗凝，立即送檢。6.注意事項采血前應(yīng)核對好姓名和檢驗(yàn)項目，明確標(biāo)本要求。采血中注意隔絕空氣，空氣中的氧分壓高于動脈血，二氧化碳分壓低于動脈血，從而使血液中PO2及PCO2都改變而無測定價值。立即送檢，血液不得放置過久，否則血細(xì)胞繼續(xù)新陳代謝，影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。6.4若靜脈采血，可將手及前臂浸人45C溫水中20分鐘，使局部靜脈血動脈化，穿刺時勿用壓脈帶，只能緩緩吸引。也可將手指或耳垂（嬰兒取足跟、大趾或頭皮）毛細(xì)血管熱敷或按摩，充分動脈化，以容量100mL-140mL肝素化毛細(xì)玻管采血。針刺深度以血液自然流出為宜，收集時切忌氣泡引入毛細(xì)玻管。標(biāo)本運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)前存放立即送檢。如不能及時送檢，應(yīng)放入冰水中保存（勿用冰快，以防細(xì)胞破壞溶血）。其它：如分析失敗，將對同一原始樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。如仍不能發(fā)出報告者，分析原因并告知受檢者重新采樣檢驗(yàn)。相關(guān)文件采樣管理程序標(biāo)本管理程序10.相關(guān)記錄尿液標(biāo)本采集作業(yè)指導(dǎo)書1.目的采集尿液標(biāo)本以做尿液常規(guī)、生化檢驗(yàn)。2.適用范圍適用于本科做尿液常規(guī)、生化項目所需尿液標(biāo)本的采集。物品準(zhǔn)備：專用一次性尿杯、編號筆。檢驗(yàn)申請單填寫要求：檢驗(yàn)申請單用鋼筆填寫，使用正楷字，字跡清楚，填寫完整。填寫內(nèi)容包括：受檢者姓名、性別、年齡、化驗(yàn)單編號、臨床診斷、送檢標(biāo)本、檢驗(yàn)項目、標(biāo)本采集標(biāo)本年月日時、申請醫(yī)生及采樣者簽名。5.操作步驟：查對檢驗(yàn)申請單、姓名，向受檢者解釋操作目的，以取得合作。發(fā)一次性尿杯一個給受檢者，囑受檢者留取新鮮尿立即送檢，以清晨第一次中間段尿?yàn)橐恕Ｊ軝z者按要求自己用一次性尿杯留取半杯尿標(biāo)本交檢驗(yàn)科編號待檢。6.注意事項6.1根據(jù)采集時間，可分為晨尿、隨機(jī)尿、空腹尿、餐后尿、計時尿（2h、3h、12h、24h）等。一般定性分析測定，可在任意時間留取標(biāo)本。常規(guī)定性分析，多采用晨尿。計時尿多用于腎功能和有形成分排出率的估計。許多定量分析需收集24小時尿液。微生物檢驗(yàn)的標(biāo)本應(yīng)取尿道排出的中段尿并立即送檢。一般尿液檢查應(yīng)留取新鮮尿液置清凈、干燥容器中立即送檢。（靜脈滴注大劑量青霉素、VitC時可影響尿蛋白、尿糖及尿隱血結(jié)果，應(yīng)盡量避免）。特殊檢驗(yàn)如尿妊娠試驗(yàn)、尿糖定性試驗(yàn)一般應(yīng)取空腹晨尿送檢。標(biāo)本應(yīng)避免污染。一般定性分析標(biāo)本，應(yīng)在留取后馬上檢測。若需保存、或收集24小時尿液，原則上應(yīng)首選0?4C冷藏，必要時可添加化學(xué)防腐劑。常用的化學(xué)防腐劑有：甲苯（或二甲苯）：較常用，如24h尿糖定量、尿蛋白定量測定。100mL尿液中加1mL。不能制止尿液中已有細(xì)菌的繁殖。氯仿：防腐效果較甲苯好?？赡芨蓴_尿沉渣鏡檢。鹽酸：分析測定甾體激素及其衍生物或兒茶酚胺以及含氮物質(zhì)時常選用。100mL尿液中加1mL，或24小時尿液中10-15mL。甲醛：100mL尿液中加0.5mL。用于24h尿無機(jī)離子定量及艾迪氏計數(shù)測定可干擾尿糖測定和干化學(xué)法的白細(xì)胞測定。其它：如分析失敗，將對同一原始樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。如仍不能發(fā)出報告者，分析原因并告知受檢者重新采樣檢驗(yàn)。相關(guān)文件采樣管理程序標(biāo)本管理程序9.相關(guān)記錄糞便標(biāo)本采集作業(yè)指導(dǎo)書目的采集糞便標(biāo)本以做糞便常規(guī)和其他檢驗(yàn)。適用范圍適用于本科做糞便常規(guī)和其他檢驗(yàn)項目所需糞便標(biāo)本的采集。物品準(zhǔn)備：專用一次性尿杯、編號筆。檢驗(yàn)申請單填寫要求：檢驗(yàn)申請單用鋼筆填寫，使用正楷字，字跡清楚，填寫完整。填寫內(nèi)容包括：受檢者姓名、性別、年齡、化驗(yàn)單編號、臨床診斷、送檢標(biāo)本、檢驗(yàn)項目、標(biāo)本采集標(biāo)本年月日時、申請醫(yī)生及采樣者簽名。5.操作步驟：查對檢驗(yàn)申請單、姓名，向受檢者解釋操作目的，以取得合作。發(fā)一次性尿杯一個給受檢者，囑受檢者留取糞便標(biāo)本一小時內(nèi)送檢。受檢者按要求自己用一次性尿杯留取糞便標(biāo)本交檢驗(yàn)科工作人員編號待檢。6.注意事項糞便常規(guī)檢驗(yàn)留取5g左右（指頭大?。?，糞便標(biāo)本應(yīng)留取新鮮糞便的病理成份，如粘液、血液（紅色或黑色部份）；若無病理成分，可各部位取材。不得被其他異物污染，不能從尿布上取糞便標(biāo)本，不得從尿壺或便盆中取標(biāo)本。潛血試驗(yàn)，應(yīng)囑患者收集標(biāo)本前3天禁食動物性食物。服用鐵劑、鉍劑、動物血液及綠葉蔬菜等可影響隱血測定應(yīng)注意避免。細(xì)菌檢查的糞便標(biāo)本應(yīng)收集于滅菌封口的容器內(nèi)，勿混入消毒劑及其它化學(xué)藥品。阿米巴滋養(yǎng)體檢測應(yīng)注意標(biāo)本保溫并立即送檢，立即檢測。血吸蟲毛蚴孵化需全量新鮮標(biāo)本（不少于30g）。其它：如分析失敗，將對同一原始樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。如仍不能發(fā)出報告者，分析原因并告知受檢者重新采樣檢驗(yàn)。8.相關(guān)文件標(biāo)本采集管理程序8.2標(biāo)本管理程序9.相關(guān)記錄前列腺液采集作業(yè)指導(dǎo)書1.目的留取前列腺液標(biāo)本以做各項檢驗(yàn)。2.適用范圍適用于本科做前列腺液分析各項目所需標(biāo)本的采集。物品準(zhǔn)備：潔凈玻片或試管。檢驗(yàn)申請單填寫要求：檢驗(yàn)申請單用鋼筆填寫，使用正楷字，字跡清楚，填寫完整。填寫內(nèi)容包括：受檢者姓名、性別、年齡、臨床診斷、送檢標(biāo)本、檢驗(yàn)項目、標(biāo)本采集年月日時、申請醫(yī)生及標(biāo)本采集者簽名。5.操作步驟：查對檢驗(yàn)申請單、姓名，向受檢者解釋操作目的、注意事項，以取得合作。由臨床醫(yī)生采用前列腺按摩術(shù)，采集前列腺液于清潔玻片上（或容器內(nèi)）立即送檢。6.標(biāo)本運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)前存放：標(biāo)本應(yīng)立即送檢。其它：如分析失敗，將對同一原始樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。8.相關(guān)文件標(biāo)本采集管理程序標(biāo)本管理程序9.相關(guān)記錄精液采集作業(yè)指導(dǎo)書1.目的留取精液標(biāo)本以做各項檢驗(yàn)。2.適用范圍適用于本科做精液分析各項目所需精液標(biāo)本的采集。物品準(zhǔn)備：專用潔凈干燥青霉素瓶。檢驗(yàn)申請單填寫要求：檢驗(yàn)申請單用鋼筆填寫，使用正楷字，字跡清楚，填寫完整。填寫內(nèi)容包括：受檢者姓名、性別、年齡、臨床診斷、送檢標(biāo)本、檢驗(yàn)項目、標(biāo)本采集年月日時、申請醫(yī)生簽名。5.操作步驟：查對檢驗(yàn)申請單、姓名，向受檢者解釋操作目的、注意事項，以取得合作。發(fā)專用干凈青霉素瓶一個給受檢者，自己采用手淫方法取精液盛于干凈小瓶中內(nèi)，送交門診檢驗(yàn)室編號待檢。6.注意事項精液檢驗(yàn)請一周內(nèi)禁欲。不能用安全套取精液送檢。一小時后取結(jié)果。（早上11：00前送檢，下午4：30前送檢）標(biāo)本運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)前存放7.1標(biāo)本立即送檢。冬季應(yīng)保溫送檢標(biāo)本。其它：如分析失敗，將對同一原始樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。9.相關(guān)文件標(biāo)本采集管理程序標(biāo)本管理程序10.相關(guān)記錄腦脊液采集作業(yè)指導(dǎo)書1.目的抽取腦脊液標(biāo)本以做常規(guī)、生化、免疫、細(xì)菌學(xué)等項目檢驗(yàn)。2.適用范圍適用于本科做常規(guī)、生化、免疫、細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的腦脊液標(biāo)本采集。物品準(zhǔn)備：一次性墊巾、復(fù)合碘消毒液、2%利多卡因、血管鉗、無菌洞巾、無菌紗布、無菌棉簽、骨髓穿刺針、口罩、載玻片，試管及無菌管等。檢驗(yàn)申請單填寫要求：檢驗(yàn)申請單用鋼筆填寫，使用正楷字，字跡清楚，填寫完整。填寫內(nèi)容包括：受檢者姓名、性別、年齡、臨床診斷、送檢標(biāo)本、檢驗(yàn)項目、標(biāo)本采集年月日時、申請醫(yī)生及采樣者簽名。5.操作步驟：部位5.1.1以髂后上棘連線與后正中線的交點(diǎn)為穿刺點(diǎn)，相當(dāng)于第3?4腰椎棘突間隙，有時也可在上一或下一腰椎間隙進(jìn)行。方法患者側(cè)臥于硬板床，背部與床面垂直，兩手抱膝緊貼腹部，頭向前胸屈曲，使軀干呈弓形，脊柱盡量后凸以增寬脊椎間隙。常規(guī)消毒，戴無菌手套，覆蓋無菌洞巾，用2％利多卡因自皮膚到椎間韌帶作局部麻醉。術(shù)者用左手固定穿刺皮膚，右手持穿刺針以垂直背部方向緩緩刺入，針尖稍斜向頭部，成人進(jìn)針深度約4?6厘米，兒童約2?4厘米。當(dāng)針頭穿過韌帶與硬腦膜時，有阻力突然消失落空感，此時可將針芯慢慢抽出，即可見腦脊液流出。放液前先接上測壓管測量壓力，正常側(cè)臥位腦脊液壓力為70?180mmH2O或40?50滴每分鐘?？勺鱍ueckenstedt試驗(yàn)，了解蛛網(wǎng)膜下腔有無阻塞。即在測初壓后，由助手先壓迫一側(cè)頸靜脈約10秒，再壓另一側(cè)，最后同時壓雙側(cè)頸靜脈。正常壓迫靜脈后，腦脊液壓力立即迅速升高一倍左右，解除壓迫后10?20秒，迅速降至原來水平，稱為梗阻試驗(yàn)陰性，示蛛網(wǎng)膜下腔通暢。若壓迫頸靜脈后，不能使腦脊液壓力升高，則為梗阻試驗(yàn)陽性，示蛛網(wǎng)膜下腔完全阻塞。若施壓后壓力緩慢上升，放松后又緩慢下降，示有不完全阻塞。顱內(nèi)壓增高者，禁作此試驗(yàn)。5.2.5撤去測壓管，收集腦脊液2-5mL送檢；腦脊液應(yīng)采集三管，第一管用于細(xì)菌培養(yǎng)檢查（無菌操作），第二管用于常規(guī)檢查，第三管用于生化檢查。5.2.6術(shù)畢，將針芯插入后一起拔出穿刺針，覆蓋消毒紗布，膠布固定。5.2.7去枕平臥4?6小時，以免引起術(shù)后低顱壓頭痛。6.注意事項嚴(yán)格掌握禁忌癥，凡疑有顱內(nèi)壓升高者必須先作眼底檢查，如有明顯視神經(jīng)乳頭水腫或有腦疝先兆者，禁忌穿刺。凡患者處于休克、衰竭或?yàn)l危狀態(tài)以及局部皮膚有炎癥，顱后窩有占位性病變者均列為禁忌。穿刺時患者如出現(xiàn)呼吸、脈搏、面色異常時，應(yīng)立即停止操作，并作出相應(yīng)處理。鞘內(nèi)給藥時，應(yīng)先放出等量腦脊液，然后再等量置換性藥液注入。標(biāo)本采集前應(yīng)核對好姓名和檢驗(yàn)項目，明確標(biāo)本要求。收集標(biāo)本后，必須立即送檢。久置可致細(xì)胞破壞，葡萄糖分解，病原菌破壞或溶解。細(xì)胞計數(shù)標(biāo)本應(yīng)注意防止凝集。標(biāo)本運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)前存放腦脊液標(biāo)本應(yīng)立即送檢。用于微生物檢驗(yàn)的標(biāo)本應(yīng)注意保溫，不可置冰箱保存。其它：如分析失敗，將對同一原始樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。如仍不能發(fā)出報告者，分析原因并告知受檢者重新采樣檢驗(yàn)。相關(guān)文件采樣管理程序標(biāo)本管理程序10.相關(guān)記錄漿膜腔積液（胸水）采集作業(yè)指導(dǎo)書1.目的抽取漿膜腔積液（胸水）標(biāo)本以做各項檢驗(yàn)。適用范圍適用于本科做生化、免疫、微生物等項目所需的漿膜腔積液（胸水）采集。物品準(zhǔn)備：一次性墊巾、復(fù)合碘消毒液、2%利多卡因、血管鉗、無菌洞巾、無菌紗布、無菌棉簽、胸腔穿刺針、一次性注射器、試管（數(shù)量和種類根據(jù)要求選取后檢查滅菌日期、有效期及有無漏氣）、試管架、編號筆、口罩。檢驗(yàn)申請單填寫要求：檢驗(yàn)申請單用鋼筆填寫，使用正楷字，字跡清楚，填寫完整。填寫內(nèi)容包括：受檢者姓名、性別、年齡、臨床診斷、送檢標(biāo)本、檢驗(yàn)項目、標(biāo)本采集年月日時、申請醫(yī)生及采樣者簽名。5.操作步驟：部位在胸部叩診實(shí)音最明顯的部位，一般取肩胛線或腋后線第7?8肋間，有時也可取腋中線第6?7肋間或腋前線第5肋間。方法取坐位，兩前臂置于椅背上，前額伏于前臂上；不能起床者可取半臥位，前臂上舉抱于枕部。常規(guī)消毒，拿無菌手套，覆蓋無菌洞巾。用2%利多卡因在下一肋骨上緣的穿刺點(diǎn)自皮膚至胸膜壁層進(jìn)行局部浸潤麻醉。術(shù)者以左手食指和中指固定穿刺部位皮膚，右手將穿刺針的三通活栓轉(zhuǎn)到與胸腔關(guān)閉處，再將穿刺針在麻醉處緩緩刺入，當(dāng)針鋒抵擋感突然消失時，將三通活栓轉(zhuǎn)至與胸腔相通，進(jìn)行抽液。注射器抽滿后，轉(zhuǎn)動三通活栓使其與外界相通，排出液體。如用較粗的長穿刺針代替胸腔穿刺針時，先將針座后連續(xù)的橡皮管用血管鉗夾住，然后進(jìn)行穿刺，進(jìn)入胸腔后再接上注射器，松開止血鉗，抽吸液體，抽滿后再次夾住橡皮管，取下注射器，將液體注入彎盤，計量及送檢,作培養(yǎng)時應(yīng)用無菌操作法留標(biāo)本。抽液結(jié)束后拔出穿刺針，覆蓋無菌紗布，稍用力壓迫片刻，用膠布固定后囑患者靜臥。6.注意事項手術(shù)前向患者說明穿刺目的，消除顧慮，精神緊張者，可于術(shù)前半小時給地西泮10mg,或可待因30mg以鎮(zhèn)靜止痛。術(shù)中密切觀察患者反應(yīng)，如有頭暈、面色蒼白、出汗、心悸、胸部壓迫感等反應(yīng)，或出現(xiàn)連續(xù)性咳嗽、氣促等現(xiàn)象，應(yīng)立即停止抽液，并皮下注射0.1％腎上腺素0.3?0.5mL或進(jìn)行其他對癥處理。一次抽液不應(yīng)過多，診斷抽液50?100mL即可；減壓抽液，首次不超過600mL,以后每次不超過1000mL；如為膿胸，每次盡量抽盡。嚴(yán)格無菌操作，操作種防止空氣進(jìn)入胸腔，始終保持胸腔血壓。標(biāo)本采集前應(yīng)核對好姓名和檢驗(yàn)項目，明確標(biāo)本要求。收集標(biāo)本后，為防止細(xì)胞變性出現(xiàn)凝固或細(xì)菌破壞溶解等，必須立即送檢。可于每1000mL標(biāo)本中加人EDTA100mg抗凝，以利于細(xì)胞涂片檢測。7.標(biāo)本運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)前存放7.1低溫條件2-8C運(yùn)輸。微生物檢驗(yàn)標(biāo)本不應(yīng)置于冰箱內(nèi)，以免細(xì)菌死亡而使培養(yǎng)陰性。其它：如分析失敗，將對同一原始樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。9.相關(guān)文件采樣管理程序標(biāo)本管理程序10.相關(guān)記錄漿膜腔積液（腹水）采集作業(yè)指導(dǎo)書1.目的抽取漿膜腔積液（腹水）標(biāo)本以做各項檢驗(yàn)。2.適用范圍適用于本科做生化、免疫、微生物等項目所需的漿膜腔積液（腹水）采集。物品準(zhǔn)備：一次性墊巾、復(fù)合碘消毒液、2%利多卡因、血管鉗、無菌洞巾、無菌紗布、無菌棉簽、、胸腔穿刺針、一次性注射器、試管（數(shù)量和種類根據(jù)要求選取后檢查滅菌日期、有效期及有無漏氣）、試管架、編號筆、口罩。檢驗(yàn)申請單填寫要求：檢驗(yàn)申請單用鋼筆填寫，使用正楷字，字跡清楚，填寫完整。填寫內(nèi)容包括：受檢者姓名、性別、年齡、臨床診斷、送檢標(biāo)本、檢驗(yàn)項目、標(biāo)本采集年月日時、申請醫(yī)生及采樣者簽名。5.操作步驟：部位左下腹臍與骼前上棘連線的中、外1/3交點(diǎn)。臍與恥骨聯(lián)合連線中點(diǎn)上方1.0厘米，偏左或偏右1.5厘米處。側(cè)臥位，在臍水平與腋中線之延長線相交處。此處常用于診斷性穿刺。少量積液，尤其有包裹性分隔時，須在B超指導(dǎo)下定位穿刺。5.2方法術(shù)前須排尿以防穿刺損傷膀胱。取坐位靠背椅上，衰弱者可取半臥位、平臥位或側(cè)臥位。常規(guī)消毒，戴無菌手套，覆蓋消毒洞巾，自皮膚至壁層腹膜以2％利多卡因作局部麻醉。術(shù)者左手固定穿刺皮膚，右手持穿刺針經(jīng)麻醉處垂直刺入腹壁，待針尖抵擋感突然消失時，示針尖已穿過壁層腹膜，即可抽取腹水，計量并留樣送檢。診斷性穿刺，可直接用20mL或50mL注射器及適當(dāng)針頭進(jìn)行；大量放液時，可用8號或9號針，并于針座接一橡皮管接容器。并留取標(biāo)本送檢,作培養(yǎng)時應(yīng)用無菌操作法留標(biāo)本。放液后拔出穿刺針，覆蓋消毒紗布，以手指壓迫數(shù)分鐘，再用膠布固定。大量放液后，需束以多頭腹帶，以防腹壓驟降。內(nèi)臟血管擴(kuò)張引起血壓下降或休克。6.注意事項術(shù)中嚴(yán)密觀察患者，如有頭暈、心悸、脈搏增快及面色蒼白等，應(yīng)立即停止操作，并作適當(dāng)處理。6.2放液不易過快、過多，肝硬化患者一次放液一般不超過3000mL,過多放液可誘發(fā)肝性腦病和電解質(zhì)紊亂。放腹水時若流出不暢，可將穿刺針稍作移動或稍變換體位。術(shù)后囑患者平臥、并使穿刺針孔位于上方以免腹水漏出。放液前、后均應(yīng)測量腹圍、脈搏、血壓、檢查腹部體征，以觀病情變化。有肝性腦病先兆，結(jié)核性腹膜炎粘連包塊、包蟲病及卵巢囊腫者禁忌穿刺。標(biāo)本采集前應(yīng)核對好姓名和檢驗(yàn)項目，明確標(biāo)本要求。收集標(biāo)本后，為防止細(xì)胞變性出現(xiàn)凝固或細(xì)菌破壞溶解等，必須立即送檢?？捎诿?000mL標(biāo)本中加人EDTA100mg抗凝，以利于細(xì)胞涂片檢測。標(biāo)本運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)前存放7.1低溫條件2-8C運(yùn)輸。微生物檢驗(yàn)標(biāo)本不應(yīng)置于冰箱內(nèi)，以免細(xì)菌死亡而使培養(yǎng)陰性。其它：如分析失敗，將對同一原始樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。相關(guān)文件采樣管理程序標(biāo)本管理程序相關(guān)記錄骨髓采集作業(yè)指導(dǎo)書1.目的抽取骨髓標(biāo)本以做骨髓細(xì)胞學(xué)檢查和血細(xì)胞化學(xué)染色及細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)。2.適用范圍適用于本科做骨髓細(xì)胞學(xué)檢查和血細(xì)胞化學(xué)染色及細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的骨髓標(biāo)本采集。物品準(zhǔn)備：一次性墊巾、復(fù)合碘消毒液、2%利多卡因、血管鉗、無菌洞巾、無菌紗布、無菌棉簽、骨髓穿刺針、口罩、載玻片。檢驗(yàn)申請單填寫要求：檢驗(yàn)申請單用鋼筆填寫，使用正楷字，字跡清楚，填寫完整。填寫內(nèi)容包括：受檢者姓名、性別、年齡、臨床診斷、送檢標(biāo)本、檢驗(yàn)項目、標(biāo)本采集年月日時、申請醫(yī)生及采樣者簽名。5.操作步驟5.1部位5.1.1骼前上棘穿刺點(diǎn)，在骼前上棘后1?2厘米。髂前上棘穿刺點(diǎn)，位于骶椎兩側(cè)，臀部上方突出的部位。胸骨穿刺點(diǎn)，位于胸骨柄或胸骨體相當(dāng)于第1、2肋間隙位置。腰椎棘突穿刺點(diǎn)，位于腰椎棘突突出處。5.2方法常規(guī)消毒，戴無菌手套，覆蓋無菌洞巾，用2％利多卡因作局部皮膚，皮下及骨膜麻醉。將穿刺針固定器固定在適當(dāng)?shù)拈L度（胸骨穿刺約1.0厘米處，髂骨穿刺約1.5厘米處）。用左手食指和中指固定在穿刺部位，以右手持針向骨面垂直刺入（胸骨穿刺則應(yīng)保持針體與骨面成30°?40°角），當(dāng)針尖接觸骨質(zhì)后則將穿刺針圍繞針體長軸左右旋轉(zhuǎn)，緩緩鉆刺骨質(zhì)，當(dāng)感到阻力消失，且穿刺針已固定在骨內(nèi)時，表示已進(jìn)入骨髓腔。5.2.3拔出針芯，放于無菌盤內(nèi)，接上干燥的10mL或20mL注射器，用適當(dāng)力量抽取，即有少量紅色骨髓液進(jìn)入注射器中，骨髓吸取量以0.1?0.2mL為宜。作培養(yǎng)時應(yīng)用無菌操作法留標(biāo)本。將抽取的骨髓液滴于數(shù)張