瘦素受體在正常大鼠下丘腦的分布

瘦素受體在正常大鼠下丘腦的分布

瘦素酶（lr）對中樞和周圍的瘦素受體（lr）起著廣泛的生物學作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),瘦素除了其調(diào)節(jié)能量代謝平衡的作用外,可能參與了肥胖性高血壓的形成,有證據(jù)提示這種作用來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。下丘腦是CNS中使機體內(nèi)環(huán)境保持平衡的最重要部位,與腦內(nèi)的其他部位存在復雜的聯(lián)系,是較高級的調(diào)節(jié)內(nèi)臟的中樞,有可能成為瘦素血壓調(diào)節(jié)的作用位點。如前所述,瘦素的作用的發(fā)揮有賴于LR的介導,盡管有報道LR廣泛分布于CNS,但尚缺乏其在下丘腦的確切定位。本研究旨在用免疫組織化學的方法觀察LR在下丘腦的分布。1材料和方法1.1實驗動物與飼料健康、成年、雄性SpragueDawley(SD)大鼠7只,體重250~285g(西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)。喂以顆粒型大鼠飼料,自由飲水,動物房溫度維持在18~24℃,光暗周期12h(7:00-19:00)。取腦組織前在上述條件下喂養(yǎng)3d。1.2載玻片片組織化學染色按常規(guī)方法麻醉和固定動物。開顱取腦,4℃4%的多聚甲醛中后固定24h,流水沖洗過夜,入80%酒精脫水,透明,石蠟包埋,連續(xù)冠狀切片,片厚10μm,粘貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上。切片分3套,4℃保存待用:第1套做尼氏染色,用于組織學定位;第2套做LR免疫組織化學染色;第3套做免疫組化陰性對照染色。1.3抗羊血清動力學采用免疫組織化學ABC法染色,所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。步驟如下:石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后,0.3%雙氧水(去離子水稀釋)封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性;枸櫞酸緩沖液(pH6.0)92℃熱修復15min;1.5%的封閉血清濕盒中孵育1h(18~20℃);加入抗LR羊血清(1∶50,購自SantaCruze公司,貨號sc-1834)孵育,4℃過夜;PBS(磷酸緩沖液)沖洗后加入生物素標記的抗羊IgG室溫孵育2h;ABC復合物(ABCstainingsystem,購自SantaCruze公司,貨號sc-2023)孵育2h;DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色;常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替第二抗體,其余步驟同上。2lr在大鼠cns分布7只SD大鼠中,有5只SD大鼠標本制備成功。分析切片發(fā)現(xiàn):多個腦區(qū)的神經(jīng)元的胞體和樹突均可見LR陽性反應(yīng)物質(zhì)(Leptinreceptor-immunoreactiveties,LR-IR)。LR-IR陽性細胞胞膜有棕色顆粒沉著,胞核及胞漿不著色,呈背景色,典型的LR-IR陽性細胞為“環(huán)樣”細胞。對照片結(jié)果為陰性。結(jié)果顯示LR在大鼠CNS分布廣泛,其中下丘腦是LR的主要存在部位,可見受體分布于下丘腦的弓狀核、室旁核、腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核、杏仁基底外側(cè)核等,此外,也可見于扣帶、海馬、視上核、腦室室管膜上皮細胞和脈絡(luò)叢等部位。下丘腦室旁核位于第3腦室(3V)頂部兩側(cè),呈楔形,核中可見LR-IR陽性細胞分布,外側(cè)細胞較大,著色深,陽性細胞相對密集,近中線處細胞較小,著色淡,分布稀疏(圖1)。背內(nèi)側(cè)核呈橢圓形,位于3V中部兩側(cè),核團輪廓欠清晰,核中可見LR-IR陽性細胞分布,著色淡,高倍鏡下可見細胞胞體三角形或圓錐形,大小較均一,胞膜上可見深棕色顆粒沉著,分布密集(圖2)。腹內(nèi)側(cè)核位于下丘腦結(jié)節(jié)區(qū)內(nèi)側(cè)帶,3V底部兩側(cè),核團大,界限較清晰,核團中有LR-IR陽性細胞分布。高倍鏡下見細胞多呈橢圓形,大小不一,胞膜著色深,染色顆粒清晰,細胞呈“環(huán)樣”改變(圖3)。此外,下丘腦弓狀核、杏仁基底外側(cè)核、扣帶、海馬及腦室室管膜上皮細胞和脈絡(luò)叢亦可觀察到LR-IR陽性細胞。均表現(xiàn)為胞膜著色,胞核及胞漿不著色,只是胞體形狀、大小、細胞分布密度存在差異。3腹內(nèi)側(cè)核與散發(fā)神經(jīng)元本研究結(jié)果顯示LR在大鼠CNS分布廣泛,其中下丘腦是LR的主要存在部位,可見受體分布于下丘腦的弓狀核、室旁核、腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核、杏仁基底外側(cè)核等。LR在大鼠腦內(nèi)的分布與人、小鼠、羊、豬等相似。LR在腦內(nèi)的分布定位,特別是在下丘腦特定核團的分布定位以及與其他神經(jīng)肽之間的關(guān)系,是近幾年生命科學研究的熱點之一。LR在上述核團的高度表達與瘦素最重要的生理功能即調(diào)節(jié)攝食、控制體重以及下丘腦的攝食調(diào)節(jié)機能相吻合。半個世紀前人們已經(jīng)認識到,下丘腦中的有些核團與進食有關(guān)。應(yīng)用腦區(qū)損傷或切斷腦區(qū)神經(jīng)通路的研究證實,下丘腦內(nèi)側(cè)區(qū)的弓狀核、室旁核、腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核、視交叉上核和外側(cè)下丘腦皆可影響攝食行為。下丘腦是CNS中使機體內(nèi)環(huán)境保持平衡的最重要的部位,與腦內(nèi)的其他部位存在著復雜的聯(lián)系,是較高級的調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動的中樞,因此,除了上述的攝食控制機能外還具有其他一些復雜的生理功能,如調(diào)控內(nèi)臟神經(jīng)系統(tǒng)、體溫、晝夜節(jié)律、本能活動、情緒等。研究發(fā)現(xiàn),腹內(nèi)側(cè)核微注射瘦素可引起循環(huán)中兒茶酚胺濃度增高,同時可以促進外周組織對葡萄糖的攝取,這一過程有賴于交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)的參與;此外,刺激背內(nèi)側(cè)核中的某些神經(jīng)元可以增交感縮血管活性、升高血壓、加快心率等;PVN中有神經(jīng)纖維投射到延髓和脊髓的自主神經(jīng)結(jié)前神經(jīng)元,并且可以分泌多種與心血管活動調(diào)節(jié)有關(guān)的物質(zhì),如血管加壓素、NO、CRF等,因此在心血管活動的調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮重要作用。因此,上述3個具有LR分布的核團有可能是瘦素激活SNS從而引起血壓改變的中樞作用位點,這有待于進一步的研究證實。海馬、扣帶屬于邊緣系統(tǒng),是與情感行為、學習記憶及神經(jīng)內(nèi)分泌等高級神經(jīng)活動相關(guān)的重要部位,因此我們推測瘦素在學習、記憶和情緒調(diào)節(jié)中也可能