不同溫度對大鼠下丘腦視上核和室旁核的影響

不同溫度對大鼠下丘腦視上核和室旁核的影響

熱反應是指人們和動物暴露在熱環(huán)境中，特別是在身體活動引起的非特異性全身反應，如身體疲勞和其他非正式全身反應的總結。它通過影響腦細胞特性,改變認知過程,繼而影響人的正常行為和生活質(zhì)量。下丘腦是一個非常重要的皮質(zhì)下中樞,在維持機體內(nèi)環(huán)境的平衡中起著非常重要的作用。下丘腦的視前區(qū)、下丘腦前區(qū)是體溫調(diào)節(jié)中樞,熱應激可激活此區(qū)的神經(jīng)元。視上核(supraopticnucleus,SON)和室旁核(paraventricularncleus,PVN)是下丘腦內(nèi)的重要核團,不僅參與水鹽平衡、血壓穩(wěn)定、生殖機能等的整合,而且也參與各種應激反應的調(diào)節(jié)。雖然關于熱刺激引起下丘腦內(nèi)Fos表達已有不少報道,但結論不一致。而且這些研究多使用單一溫度,對不同溫度之間Fos表達的比較注意不夠。有報道指出在高熱刺激下(40～43℃,60min左右),腦內(nèi)結構(大腦皮質(zhì)、小腦等)發(fā)生損傷性改變,甚至引起凋亡。Fos蛋白是細胞活性的標記物。我們已往的研究表明,Fos蛋白也可作為細胞損傷的標志,在γ射線照射前腦后90d,在腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)3種Fos陽性細胞,即Fos陽性胞核、Fos陽性胞漿以及Fos陽性胞核和胞漿。不同程度的高溫刺激后動物會發(fā)生怎樣的變化,SON和PVN細胞的Fos表達如何?本實驗模擬24℃,34℃,38.5℃和42℃的熱環(huán)境,觀察了動物的行為學反應和下丘腦SON和PVN內(nèi)Fos蛋白的表達情況。材料和方法1.飼養(yǎng)環(huán)境的分組健康成年雄性SD大鼠40只,購于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心,體重240～300g,安靜溫暖、避強光的環(huán)境中飼養(yǎng)48h。利用隨機數(shù)字表將其均分為4組,即24℃(對照組)、34℃、38.5℃、42℃4種不同環(huán)境溫度組,每組10只。飼養(yǎng)條件為:22±1℃,相對濕度40%～50%,自然晝夜比12∶12h,非直接光照,自由飲食。2.建立熱應激動物模型將動物暴露于恒溫恒濕動物箱(第四軍醫(yī)大學航空航天醫(yī)學系自制)中,溫度分別為34℃、38.5℃、42℃,相對濕度均為60%,各60min,建立熱應激動物模型。同時設24℃組為正常對照組。3.行為觀察實驗過程中注意觀察大鼠在高溫環(huán)境中的行為表現(xiàn),如姿勢、活動情況及有無出汗等。4.前腦冠狀切片動物暴露于恒溫恒濕動物箱1h后,用1%戊巴比妥鈉(80mg/kg)麻醉,經(jīng)左心室至升主動脈插管,100ml生理鹽水沖洗血液,4℃含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)灌注固定。腦組織置于含20%蔗糖的0.1mol/LPB內(nèi)(4℃)至沉底。恒冷箱切片機切制含SON和PVN的前腦冠狀切片,片厚30μm。切片收集于0.01mol/LPBS中,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。切片行抗Fos免疫組織化學(ABC法)染色。5.fos-多克隆抗體稀釋液切片入0.3%H2O2甲醇溶液20min,PBS液充分漂洗,入0.3%TritonX-100處理后,按ABC法切片依次孵育于:(1)兔抗Fos多克隆抗體稀釋液(1∶3000,SantaCruz),24h,4℃;(2)生物素標記的羊抗兔IgG稀釋液(1∶500,Sigma),2h,室溫;(3)生物素-卵白素-HRP復合物(ABC,1∶500,Sigma),2h,室溫。以上每一步驟后均用PBS充分漂洗3次,每次10min,最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺法顯色(室溫),陽性產(chǎn)物呈藍色,常規(guī)裱片、脫水、透明、DPX封固、光鏡觀察。6.替代實驗取實驗組切片,用0.01mol/LPBS分別替代抗Fos抗體稀釋液,按ABC法進行免疫組化染色,結果為陰性。7.大鼠好c組fos陽性神經(jīng)元的檢測光鏡下(BX-60,Olympus,Japan)觀察并應用Leica公司的Quantimet570c圖像分析儀采集圖像。對每組10只大鼠,每只大鼠2張下丘腦PVN和SON切片的Fos陽性神經(jīng)元進行計數(shù)。結果以均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,行單因素方差分析(one-wayANOVA)結果1.獨立中的病理狀態(tài)大鼠的基礎體溫一般為36～38℃。在34℃的環(huán)境下,大鼠直腸溫度變化幅度不大,未超過39℃,活動正常。38.5℃的條件下,直腸溫度常升高達39℃以上;可見頭頸部及胸部毛發(fā)潮濕,表示有脫水象征;最初大鼠精神萎靡,活動減少,但隨直腸溫度增高,轉(zhuǎn)為興奮狀態(tài),出現(xiàn)驚跳、逃竄行為。處于42℃的環(huán)境中,大鼠的體溫達42℃以上,無法用普通溫度計測量。2.免疫組織化學2.1pvn和son內(nèi)的fos陽性胞核對照組大鼠PVN,SON內(nèi)有少量Fos陽性神經(jīng)元分布,其胞核為藍黑色,胞質(zhì)為陰性,染色淺,散在分布(Fig.1A,E)。34℃時,PVN和SON內(nèi)的Fos陽性神經(jīng)元增多,與正常組相比有明顯差異(P<0.05,Fig.1B,F)。38.5℃時,PVN和SON內(nèi)的Fos陽性胞核明顯增加,達到峰值,與其他各組比較均有顯著差異(P<0.05),Fos陽性胞核分布于整個核團(Fig.1C,G)。42℃時,PVN和SON內(nèi)的Fos陽性胞核明顯降低,與38.5℃組相比,有顯著差異(P<0.05,Fig.1D,H)。各組PVN和SON內(nèi)的Fos陽性細胞計數(shù)結果詳見表1。2.2fos蛋白表達對照組大鼠PVN和SON內(nèi)Fos蛋白集中表達在胞核,表現(xiàn)為一圓形藍色的胞核,胞質(zhì)為陰性(Fig.1A,E)。34℃和38.5℃時,Fos蛋白僅在胞核表達,染色較深,胞質(zhì)仍為陰性。42℃時,Fos蛋白陽性產(chǎn)物明顯減少,可見到三種細胞,第1種是胞核陽性,胞漿陰性的細胞;第2種是胞漿陽性,而胞核為陰性的細胞;第3種是胞漿與胞核雙陽性的細胞。值得注意的是腦內(nèi)所有對熱刺激起反應的部位(大腦皮質(zhì)、海馬、杏仁核簇、臂旁核和孤束核等)的神經(jīng)元也都出現(xiàn)上述3種表型(Fig.2)。熱應激對fos蛋白表達的影響熱應激是指人或動物暴露在熱環(huán)境中,尤其是伴有體力活動時,產(chǎn)生可感知的不適感和疲勞等一系列非特異性全身應答反應的總和。長期的熱應激,可引發(fā)一系列因生理機能紊亂引起的異常反應,如體溫的升高、大量出汗引起機體脫水以及水電解質(zhì)平衡紊亂,中暑,某些器官或組織受損,認知行為改變,甚至休克和死亡。下丘腦神經(jīng)元參與感受和調(diào)控體溫,它是人體的體溫調(diào)節(jié)中樞。因此,研究熱應激后,下丘腦內(nèi)神經(jīng)元的一系列改變,對于了解熱應激影響機體功能的途徑、從而進一步運用于臨床治療都很有意義。Fos蛋白作為神經(jīng)元活動狀態(tài)的標記物,已被廣泛采用。本文采用Fos蛋白免疫標記法,研究了下丘腦PVN和SON內(nèi)神經(jīng)元對不同熱刺激的反應。原癌基因c-fos是一種胞內(nèi)的第三信使,它對許多刺激很敏感,但缺乏特異性。為了尋找Fos表達與熱刺激的特異性關系,我們對動物的實驗條件作了嚴格的限制,盡量減少不必要的非特異刺激。我們觀察到:24℃時,Fos陽性細胞較少,散在分布;熱應激后,大鼠中樞內(nèi)多個部位出現(xiàn)Fos表達。34℃組,PVN和SON內(nèi)有少量的Fos陽性神經(jīng)元表達。38.5℃時,PVN和SON內(nèi)的Fos陽性細胞數(shù)量明顯增加,達到峰值,大鼠出現(xiàn)出汗,脫水癥狀。表明此時大鼠體內(nèi)的滲透壓已發(fā)生改變,機體處于高滲狀態(tài)。SON和PVN不僅是維持機體水鹽平衡的重要中樞,也參與對損傷、應激等反應的調(diào)節(jié),此時Fos蛋白集中分布于這兩個核團,說明高溫激活了此區(qū)的神經(jīng)元,進而影響動物的行為反應。42℃時,SON和PVN的Fos陽性神經(jīng)元數(shù)量下降,我們推測可能是由于高溫使機體受到損傷,各項反應反而處于抑制狀態(tài)的原因。我們的結果與Tsay等和McKitrick的結果一致。本文另一有意義的結果是:對照組、34℃和38.5℃組大鼠腦內(nèi)Fos陽性神經(jīng)元,Fos在胞核表達,染色淺,胞質(zhì)為陰性;而在42℃時,出現(xiàn)了三種形態(tài)的Fos陽性細胞:即胞核陽性,胞漿陰性;胞漿陽性,胞核陰性和胞漿與胞核雙陽性的細胞。這與Duan等報道的γ刀照射大鼠后大鼠腦內(nèi)出現(xiàn)了三種Fos陽性細胞一致。眾所周知,當細胞受到刺激后,胞核內(nèi)c-fosmRNA轉(zhuǎn)移到胞漿,由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄翻譯為Fos蛋白,Fos蛋白與Jun蛋白合成二聚體,在AP-1的介導下易位到胞核,激動靶基因。當細胞嚴重受損時,Fos蛋白從胞漿向胞核的轉(zhuǎn)運機制可能存在障礙,無法向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運,于是出現(xiàn)了胞漿單陽性的細胞。因此,我們推測,Fos蛋白僅表達在胞核、胞漿為陰性的細胞是正常的反應性細胞,Fos蛋白只表達在胞漿、胞核為陰性的細胞是嚴重受損的細胞,胞漿、胞核同時表達Fos的細胞是介于兩者之間的過渡型細胞。值得注意的是我們