煙草a34花絨氈層轉(zhuǎn)基因油菜的獲得

煙草a34花絨氈層轉(zhuǎn)基因油菜的獲得

芥末是我國(guó)特產(chǎn)蔬菜之一，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。它在中國(guó)南部和北部廣泛種植，這是一個(gè)重要的加工蔬菜。在芥菜生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛存在著諸如病毒病、先期抽薹、加工品質(zhì)等問(wèn)題(楊景華等,2006),植物雜種優(yōu)勢(shì)的利用可以在一定程度上解決這些問(wèn)題。由于芥菜類(lèi)作物自交親和指數(shù)非常高,雜種優(yōu)勢(shì)育種難以通過(guò)自交不親和途徑得以實(shí)現(xiàn),導(dǎo)致長(zhǎng)期以來(lái)芥菜類(lèi)蔬菜品種選育都是以常規(guī)品種為主。雖然近年來(lái)利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育在芥菜優(yōu)勢(shì)育種上取得了一定的進(jìn)展,但如何發(fā)掘、創(chuàng)造優(yōu)良的芥菜雄性不育材料仍是當(dāng)前芥菜雄性不育研究的重要內(nèi)容之一。隨著基因工程雄性不育系成功在油菜、玉米、菊苣等農(nóng)作物上得到商業(yè)化應(yīng)用(Kempken,2010),圍繞花粉的發(fā)育過(guò)程,已通過(guò)多種途徑建立了植物工程雄性不育系。利用具有特異時(shí)空表達(dá)特性的花藥絨氈層特異啟動(dòng)子與解淀粉芽孢桿菌的Barnase核糖核酸酶基因融合,導(dǎo)入植物體內(nèi)調(diào)控花粉發(fā)育,從而獲得雄性不育材料成為其中應(yīng)用最為普遍的方法。該方法分別在花椰菜(Reynaertsetal.,1993)、煙草(李勝國(guó)等,1995)、油菜(鐘蓉等,1996)、甘藍(lán)(沈革志等,2001)、番茄(白玲等,2002)、菜薹(曹必好和孟成民,2008)等作物上成功獲得了雄性不育材料?；趯?duì)芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)制的研究,Yang等(2010)將來(lái)自線粒體的編碼基因orf220導(dǎo)入莖用芥菜中獲得雄性不育材料。相對(duì)于其他農(nóng)作物,有關(guān)芥菜植物基因工程雄性不育的研究報(bào)道較少,為拓寬芥菜雄性不育資源,本試驗(yàn)將煙草絨氈層TA29啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的Barnase基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入莖用芥菜,獲得了轉(zhuǎn)基因雄性不育芥菜植株,從分子水平、細(xì)胞學(xué)水平和結(jié)籽情況等方面調(diào)查分析了轉(zhuǎn)基因植株的育性,結(jié)果顯示Barnase基因在芥菜絨氈層特異表達(dá)后能導(dǎo)致徹底的雄性不育,但伴隨花朵變小,雌蕊、種莢變短,結(jié)籽數(shù)量下降的現(xiàn)象。1材料和方法1.1s19-bn的農(nóng)桿菌含雄性不育基因的表達(dá)載體pCABarTA29-Bn的農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105由南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存(圖1)。1.2聚合酶和dna生物技術(shù)試驗(yàn)于2012年2月7日~7月15日在西南大學(xué)南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試芥菜品種為渝豐榨菜,由重慶科光種苗有限公司提供。TaqDNA聚合酶和DNAmarker購(gòu)自全式金生物工程有限公司;羧芐青霉素(Carbenicilin)、卡那霉素(Kanamycine)、鏈霉素(Streptomycin)、吲哚乙酸(IAA)、6芐基腺嘌呤(6-BA)以及細(xì)菌培養(yǎng)基均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司;植物DNA提取、植物組織培養(yǎng)以及顯微制片的各種化學(xué)藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。除草劑Basta(草丁膦,主要成分為PPT)購(gòu)自日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株氏會(huì)社。1.3再生植株的培養(yǎng)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法(王關(guān)林和方宏筠,2002;曹必好等,2003)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,并略有改動(dòng):取苗齡7d的渝豐榨菜幼苗的下胚軸,切成1cm長(zhǎng)的莖段,在分化培養(yǎng)基(MS+2mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+3%蔗糖+0.6%瓊脂)上預(yù)培養(yǎng)2d,用濃度OD600=0.5~0.6的農(nóng)桿菌菌液侵染10min,轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d,隨后在篩選培養(yǎng)基(MS+2mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+8mg·L-1PPT+400mg·L-1Carb+3%蔗糖+0.6%瓊脂)上進(jìn)行多次篩選,每14d換1次培養(yǎng)基,最后將再生植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(MS+0.2mg·L-1NAA+8mg·L-1PPT+400mg·L-1Carb+3%蔗糖+0.6%瓊脂)上進(jìn)行生根培養(yǎng)。1.4ta29啟動(dòng)子和下游barnase基因的pcr檢測(cè)采用改進(jìn)的CTAB法提取芥菜總DNA(宋洪元等,2010)。以提取的總DNA為模板,用TA29啟動(dòng)子上游引物(TA29-1:5′-CGCGGTACCCCAAGATTGCATAAG-3′)和Barnase基因下游引物(BN-2:5′-CCCCTCGGATCCGTTATCTGATCTTTGTA-3′)進(jìn)行TA29啟動(dòng)子及下游Barnase基因的PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系:模板DNA1μL(30ng·μL-1),上下游引物各1μL(10ng·μL-1),dNTPMixture0.2μL(2.5mmol·L-1),MgCl22.0μL(25mmol·L-1),TaqDNA聚合酶0.3μL(5U·μL-1),10×Buffer2.5μL,ddH2O補(bǔ)至總體積為25μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性40s,56℃退火40s,72℃延伸2min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.5形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察取轉(zhuǎn)基因以及野生型芥菜植株當(dāng)天開(kāi)放的花,觀察比較雄蕊和花藥的形態(tài)結(jié)構(gòu)。分別調(diào)查雄性不育轉(zhuǎn)基因芥菜植株自交以及用野生型芥菜植株的花粉進(jìn)行人工授粉后的結(jié)籽情況。1.6c組的制作取芥菜轉(zhuǎn)基因雄性不育株和野生型可育株的不同大小花蕾,投入FAA固定液固定至少24h,之后按照常規(guī)石蠟法制作切片(鄒瑞昌等,2012):各級(jí)酒精脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→展片→脫蠟→染色,最后在LEICACTR5000顯微鏡下鏡檢并照相。2結(jié)果與分析2.1成活率豬肉植株的篩選芥菜幼苗下胚軸經(jīng)農(nóng)桿菌菌液浸染后,在含除草劑有效成分8mg·L-1PPT的培養(yǎng)基上進(jìn)行多輪篩選,篩選過(guò)程中非轉(zhuǎn)化個(gè)體逐漸黃化死亡,抗性個(gè)體成苗并正常生根,生根后移栽到土壤中,獲得5株成活轉(zhuǎn)基因芥菜植株(圖2)。提取成活植株DNA,利用引物TA29-1和BN-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在5株轉(zhuǎn)基因植株中均獲得了約630bp的DNA片段(圖3),表明外源目的基因已整合到芥菜植物基因組中。2.2花瓣氣調(diào)明顯盡管獲得的轉(zhuǎn)基因芥菜植株與野生型植株形態(tài)間無(wú)明顯差異,但開(kāi)花時(shí)轉(zhuǎn)基因植株花朵偏小,并伴隨花瓣較小、雌蕊短且粗、雄蕊短縮的現(xiàn)象;而野生型植株則表現(xiàn)為花瓣大、雌蕊細(xì)長(zhǎng)、雄蕊粗壯(圖4)。同時(shí),轉(zhuǎn)基因植株花藥瘦小、干癟、無(wú)花粉囊及花粉;野生型植株則花藥飽滿,花粉囊充滿大量花粉(圖5)。2.3生物測(cè)序和生殖情況在TA29啟動(dòng)子的作用下,Barnase基因在花藥絨氈層組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá),產(chǎn)生水解絨氈層組織細(xì)胞內(nèi)的RNA的核糖核酸水解酶,阻礙花藥絨氈層的發(fā)育,從而導(dǎo)致雄性不育的產(chǎn)生。顯微切片結(jié)果顯示(圖6),花藥發(fā)育早期,轉(zhuǎn)基因芥菜植株與野生型植株均在花藥的4個(gè)角隅處形成正常的藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層和造孢細(xì)胞,呈蝴蝶形排列(圖6-1,6-4)。野生型植株進(jìn)入減數(shù)分裂期,花粉母細(xì)胞變?yōu)闄E圓形,絨氈層細(xì)胞體積增大;進(jìn)入單核初期,剛釋放出來(lái)的游離小孢子形狀不規(guī)則,細(xì)胞壁很薄;單核晚期,細(xì)胞壁逐漸加厚且趨于圓球形,絨氈層開(kāi)始降解(圖6-2);單核小孢子發(fā)生有絲分裂后,進(jìn)入二核期,絨氈層只余殘跡,生殖核再次有絲分裂形成兩個(gè)精核,花粉粒趨于成熟,絨氈層最后在花藥即將開(kāi)裂釋放花粉粒時(shí)已完全消失(圖6-3)。而轉(zhuǎn)基因植株的花藥中,當(dāng)花粉母細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí),藥室內(nèi)壁的絨氈層細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始降解,并伴隨花粉母細(xì)胞的退化(圖6-5);減數(shù)分裂后絨氈層細(xì)胞和花粉母細(xì)胞進(jìn)一步退化解體,無(wú)小孢子母細(xì)胞釋放,藥室呈現(xiàn)空洞狀(圖6-6)。2.4結(jié)籽正常,以水加酵母株為原料的誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)基因雄性不育芥菜植株開(kāi)花后,自交花朵的果莢基本不能膨大,部分脫落,無(wú)種子形成(圖7-A1),而野生型植株則結(jié)籽正常(圖7-B)。轉(zhuǎn)基因植株用野生型植株的花粉授粉后,基本均能結(jié)實(shí)(圖7-A2),但與野生型植株(圖7-C2)相比果莢較短,不飽滿,且種子數(shù)少(圖7-C1)。該結(jié)果顯示煙草TA29啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Barnase基因在芥菜植株的花藥絨氈層表達(dá)后,除了影響絨氈層細(xì)胞的發(fā)育從而獲得雄性不育外,對(duì)雌蕊以及其他花器官的發(fā)育也有一定的影響。3溫度對(duì)患者雄性不育行為的影響TA29是從煙草中克隆的一個(gè)絨氈層特異表達(dá)基因,在煙草減數(shù)分裂期到小孢子有絲分裂期的絨氈層中特異表達(dá),在其他器官和花的其他組織中均沒(méi)有表達(dá)(Koltunowetal.,1990)。該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Barnase基因在絨氈層中表達(dá)后獲得了煙草和油菜雄性不育材料(Marianietal.,1990)。隨后基于TA29-Barnase雄性不育的轉(zhuǎn)基因油菜獲得商業(yè)化應(yīng)用。然而,后來(lái)有研究顯示TA29-Barnase基因?qū)е碌男坌圆挥龑?duì)溫度敏感,在溫度升高后轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)不同程度的育性恢復(fù)現(xiàn)象。如在轉(zhuǎn)基因煙草和油菜的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度低于20℃時(shí)不育性穩(wěn)定,溫度升高到25℃時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)育,30℃時(shí)大部分可育(鐘蓉等,1996)。另外,TA29-Barnase基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)后發(fā)現(xiàn)雄性不育植株的園藝學(xué)性狀與未轉(zhuǎn)化植株相同,不育植株的花朵表現(xiàn)為雄蕊完全退化,但蜜腺和雌蕊健全,能接受外來(lái)花粉,雜交結(jié)實(shí)率較高,但是轉(zhuǎn)基因植株中存在全不育植株和半不育植株,半不育植株在開(kāi)花中后期出現(xiàn)育性恢復(fù)現(xiàn)象(沈革志等,2001)。該基因在菜薹中表達(dá)后產(chǎn)生的雄性不育植株在30~35℃/25~28℃的高溫條件下自交全部不能結(jié)籽,沒(méi)有育性恢復(fù)現(xiàn)象發(fā)生(曹必好和孟成民,2008)。本試驗(yàn)利用該基因獲得的芥菜雄性不育植株的生長(zhǎng)發(fā)育全程處于控溫條件下的人工氣候室內(nèi),其雄性不育性是否受田間溫度變化的影響有待進(jìn)一步研究。通過(guò)原位雜交和啟動(dòng)子報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因分析顯示,TA29基因?qū)Ｒ恍缘卦诮q氈層細(xì)胞中表達(dá),表達(dá)時(shí)期為減數(shù)分裂期到花粉壁增厚期(-1到+6期)(Koltunowetal.,1990)。但在棉花中的研究結(jié)果顯示,該啟動(dòng)子除了在棉花花藥中優(yōu)勢(shì)表達(dá)外,其控制的基因也會(huì)在棉花的葉片表皮毛和花粉中表達(dá)(尹夢(mèng)回等,2008)。同時(shí),TA29-Barnase轉(zhuǎn)基因棉花除花藥干癟、花粉無(wú)活力外,也表現(xiàn)出花朵變小、花絲變短等現(xiàn)象(Zhangetal.,2007),這與