蛋白質(zhì)組學(xué)與中醫(yī)證候研究的互融性

蛋白質(zhì)組學(xué)與中醫(yī)證候研究的互融性

蛋白質(zhì)組學(xué)是繼基因和基因組學(xué)之后最受關(guān)注的生物研究領(lǐng)域之一。自1994年澳大利亞科學(xué)家威廉姆斯和韋格勒提出了相關(guān)概念以來，僅花了10多年的時間，而中國的正式研究只有幾年時間。然而，蛋白質(zhì)組的研究非常迅速。由于蛋白質(zhì)組在疾病發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療中所具有的重要性,且它的很多特性與中醫(yī)“證”的特征十分吻合,因此將蛋白質(zhì)組引入中醫(yī)證實(shí)質(zhì)的研究具有特別重要的意義。中醫(yī)證候的實(shí)質(zhì)研究中醫(yī)與西醫(yī)的重大區(qū)別之一是解釋疾病發(fā)生原因的著眼點(diǎn)不同,西醫(yī)基于“實(shí)體中心論”,即注重物質(zhì)基礎(chǔ),而中醫(yī)則基于“關(guān)系中心論”,關(guān)注功能與相互關(guān)系。作為中醫(yī)臨床用藥最主要的理論根據(jù),或者說中醫(yī)臨床診治疾病最重要的方法是辨證論治,它是中醫(yī)特有的概念,是聯(lián)系中醫(yī)基礎(chǔ)理論與臨床的橋梁?！白C”是對疾病所處一定階段的病因、病性與病位等所作的概括。由于中醫(yī)對疾病的注重從整體和宏觀的角度認(rèn)識事物,善于采用比類取象、司外揣內(nèi)等思維方法來觀察和研究人體的生理功能和病理變化,辨證的過程實(shí)際上是通過疾病外在表象的收集進(jìn)行綜合分析,從而推測演繹出疾病的病因、病性、病位、病勢等要素進(jìn)而歸納出“證”的過程,它是一種“功能態(tài)”,是機(jī)體內(nèi)因外因相互作用的結(jié)果,并可能隨著疾病的發(fā)展而發(fā)生變化,因此中醫(yī)的證候具有整體性、動態(tài)性、時相性、復(fù)雜性等特點(diǎn),除出現(xiàn)“同病異證”外,“異病同證”的現(xiàn)象也十分常見。由于“證”無論在中醫(yī)基礎(chǔ)理論還是中醫(yī)臨床中都具有十分重要的地位,近幾十年來對“證”實(shí)質(zhì)的研究進(jìn)行了十分有益的探索。證候?qū)嵸|(zhì)的研究主要從證的臟腑、陰陽、虛實(shí)、病邪性質(zhì)等角度展開,例如陰虛證和陽虛證、脾氣虛證和脾陽虛證、痰濁證和血瘀證等。涉及的化學(xué)物質(zhì)主要有激素、酶類、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、三磷酸腺苷(AMP)、神經(jīng)遞質(zhì)、微量元素等。研究證候的方法多種多樣,如主癥辨證法、主次癥判斷法、微觀辨證法、混沌學(xué)方法、分析綜合法、功能定量法、多學(xué)科多層次多因素分析法等,但其發(fā)展方向歸納起來主要有2個:一是整體研究法,或稱宏觀綜合法,即在傳統(tǒng)繼承為主的基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新,在不破壞中醫(yī)傳統(tǒng)理論的前提下,以整體觀和辨證論為基礎(chǔ),在整體的層次上從宏觀的角度進(jìn)行研究,這類研究注重的是功能模擬和各系統(tǒng)之間的聯(lián)系,較多地采用臨床流行病學(xué)和數(shù)學(xué)的方法,系統(tǒng)地探討中醫(yī)證候的演變規(guī)律、證名和證候內(nèi)涵的規(guī)范化、證的分級量化等。一是微觀分析法,即采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)還原研究為主的方法,用實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)闡釋證候機(jī)理或?qū)ψC候做出定量診斷,此類研究注重的是實(shí)體結(jié)構(gòu)和微觀指標(biāo)。由于兩類方法在認(rèn)識方法、研究手段、觀察角度等方面各不同,研究的結(jié)論必然有異,其優(yōu)劣長短亦各不相同。事實(shí)上,微觀組成整體,整體包含微觀,了解微觀才能對證的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行深層次研究,研究整體方能對系統(tǒng)的功能和系統(tǒng)之間的聯(lián)系全面了解?！白C”作為一種功能表現(xiàn)或一種有規(guī)律的病理表現(xiàn),必然有其物質(zhì)結(jié)構(gòu)來支配它,中醫(yī)“有諸內(nèi),必形諸外”也從另一角度說明了內(nèi)在物質(zhì)結(jié)構(gòu)是外在功能表現(xiàn)的基礎(chǔ)。在對證實(shí)質(zhì)的研究中,由于多數(shù)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)缺乏特異性,因此很難用單一指標(biāo)來作定性、定量、定位的說明,也難以反映中醫(yī)證候的整體性和復(fù)雜性。近些年開始從基因和蛋白質(zhì)組學(xué)角度研究“證”實(shí)質(zhì),尤其是將蛋白質(zhì)組學(xué)引入中醫(yī)證實(shí)質(zhì)研究受到普遍重視。蛋白質(zhì)組學(xué)研究內(nèi)容蛋白質(zhì)組(proteome)是指一個細(xì)胞或一個組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì),是對應(yīng)于一個基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體,由于在人體組織的不同發(fā)育階段、不同生理?xiàng)l件或不同的環(huán)境影響下,其蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)各不相同,因此蛋白質(zhì)組是一個在時空和時間上動態(tài)變化著的整體。蛋白質(zhì)既是生物體最重要的結(jié)構(gòu),又是生命活動的直接執(zhí)行者,它的組成遠(yuǎn)比基因龐大和復(fù)雜,具有相對獨(dú)立的代謝過程,對生物機(jī)體內(nèi)部和外部因素具有產(chǎn)生反應(yīng)的能力,而且蛋白質(zhì)之間存在著活躍、廣泛的相互作用,因此蛋白質(zhì)組是基因組研究的邏輯發(fā)展。與具有同源性和普遍性的基因相比,蛋白質(zhì)組具有動態(tài)性、時間性、空間性、特異性等特征。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)則是指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興學(xué)科,其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平和修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動規(guī)律。其現(xiàn)階段主要研究內(nèi)容是了解某種特定的細(xì)胞、組織或器官的蛋白質(zhì)種類,確定其數(shù)量,分析并描繪其三維結(jié)構(gòu);了解各蛋白質(zhì)的功能和相互作用。目前主要研究手段有雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)、生物質(zhì)譜技術(shù)(bio-massspectrometry)、蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)和生物信息學(xué)(bioinformatics)技術(shù)等。蛋白質(zhì)組學(xué)的特點(diǎn)是采取高分辨率蛋白質(zhì)分離手段,結(jié)合高效率的鑒定技術(shù),全景式的展示各種特定情況下的蛋白質(zhì)譜,組織細(xì)胞在一定階段或某一狀態(tài)下相關(guān)的蛋白質(zhì)譜時、空、量效方面的變化,其最大的特色在于建立了以整體觀來剖析生命現(xiàn)象的理念。蛋白質(zhì)組的整體性、動態(tài)性、時空性、復(fù)雜性與同樣具有整體性、動態(tài)性、時相性、復(fù)雜性等特點(diǎn)的中醫(yī)“證”有著驚人的相似,其中可能存在某種內(nèi)在聯(lián)系和對應(yīng)關(guān)系。因此,與“證”實(shí)質(zhì)研究中一般的微觀指標(biāo)相比,蛋白質(zhì)組學(xué)有著特殊的優(yōu)勢,也更加符合證自身的特點(diǎn)。提出最佳模型的檢測除進(jìn)行證候蛋白質(zhì)組相關(guān)性的理論探討之外,目前已有眾多的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道,主要就蛋白質(zhì)組在中醫(yī)證型研究中的技術(shù)條件、思路方法以及具體證型與蛋白質(zhì)組的相關(guān)性展開研究。黃黎明等在分析了蛋白質(zhì)組學(xué)與證候的內(nèi)在聯(lián)系的同時,對證型特點(diǎn)、造模方法、蛋白質(zhì)組學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行分析,提出采用雙向電泳(2-DE)+質(zhì)譜(MS)+數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)組解決方案及藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,是探求腎陽虛證的蛋白質(zhì)學(xué)本質(zhì)較好的方法。鐘小蘭等在常規(guī)蛋白質(zhì)組2-DE分離技術(shù)的基礎(chǔ)上對血清樣品處理、膠條選擇、上樣量和聚焦參數(shù)等加以優(yōu)化從而摸索新的方法。結(jié)果建立了穩(wěn)定的血清蛋白質(zhì)組2-DE分離技術(shù),運(yùn)用于肝郁證相關(guān)蛋白組研究,在大鼠血清中獲取了12個差異蛋白,在人血清中亦初步篩選出12個差異蛋白點(diǎn),其方法具有穩(wěn)定性、可重復(fù)性。譚秦湘等通過檢索Medline和中國期刊網(wǎng)1995-01至2005-12關(guān)于血清蛋白組學(xué)技術(shù)應(yīng)用及證候蛋白質(zhì)組理論探討的相關(guān)文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法,可以研究不同疾病肝郁證中血清蛋白質(zhì)的變化規(guī)律及特異蛋白質(zhì)的表達(dá)規(guī)律,就有可能在復(fù)雜的多種致病因素下找到證候的本質(zhì)并建立肝郁證候的微觀辨證指標(biāo)體系。吳紅金等采集正常健康者、冠心病心血瘀阻證病人的血漿,用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)測定冠心病血瘀證與正常人血漿中的蛋白變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證病人血漿與正常相比有3個蛋白質(zhì)下調(diào)和6個蛋白質(zhì)上調(diào),膠內(nèi)酶切提取蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,其中冠心病血瘀證病人血漿與正常相比升高的蛋白質(zhì)有免疫球蛋白、纖維蛋白原、粒酶,冠心病血瘀證病人血漿與正常相比降低的蛋白質(zhì)有細(xì)胞表面糖蛋白(CD44SP)。因而認(rèn)為纖維蛋白原、粒酶有望作為診斷冠心病血瘀證的標(biāo)志物。鐘小蘭等以束縛制動法制備肝郁證大鼠模型,運(yùn)用蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個具有明顯表達(dá)差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn),經(jīng)鑒定可以確定的6個蛋白質(zhì),分別為轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin,TTR)、水解酶Bal-647、血清白蛋白前體、抗乙酰膽堿受體抗體Fab片段、Igλ-2鏈C區(qū)和β1球蛋白。其篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要涉及免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌和營養(yǎng)物質(zhì)代謝方面,和現(xiàn)有研究結(jié)果相符,證實(shí)從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度研究證實(shí)質(zhì)是可行的。劉麗麗等在四物湯對環(huán)磷酰胺致血虛證小鼠骨髓蛋白質(zhì)組影響的研究中發(fā)現(xiàn),環(huán)磷酰胺使小鼠骨髓中l(wèi)2個蛋白表達(dá)上調(diào)、3個蛋白達(dá)下調(diào),四物湯可使CTX造模后這些表達(dá)改變的蛋白有不同程度恢復(fù)。認(rèn)為四物湯可能通過影響與細(xì)胞凋亡、血干祖細(xì)胞增殖分化有關(guān)的蛋白質(zhì)而促進(jìn)骨髓造血。謝文光等在研究赤芍藥對大鼠熱毒血瘀證的血清蛋白質(zhì)組變化的影響中發(fā)現(xiàn),用脂多糖(LPS)造模所致熱毒血瘀證大鼠的血清在2-DE膠上13個蛋白點(diǎn)(xPr)出現(xiàn)非常明顯的含量變化,與正常組比較,LPS組的xPrl6、xPrl9的點(diǎn)容量值均顯著降低,xPrl、xPr2、xPr3、xPr4、xPr6、xPr7、xPr8、xPr9、xPrl1、xPrl2、xPr23的點(diǎn)容量值均顯著增高。盧德趙等應(yīng)用凝膠內(nèi)差異顯示電泳技術(shù)研究腎陽虛大鼠肝線粒體蛋白質(zhì)組,8個分別來自于腎陽虛大鼠和正常大鼠的肝線粒體蛋白質(zhì)樣品(各4個)分別用熒光染料Cy3、Cy5標(biāo)記,以及8個樣品等量混合物用Cy2標(biāo)記作為內(nèi)標(biāo),每一Cy3、Cy5標(biāo)記樣品與Cy2標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)等量混合后在同一膠中進(jìn)行電泳分離,經(jīng)不同光激發(fā)后掃描得到不同樣品的蛋白質(zhì)組圖譜。經(jīng)DeCyder軟件結(jié)合內(nèi)標(biāo)分析,獲得16個差異蛋白質(zhì),經(jīng)質(zhì)譜測定和與蛋白質(zhì)文庫比對,鑒定出11個蛋白質(zhì)。其中,腎陽虛動物熱休克蛋白60和70、肌氨酸脫氫酶、氨甲酰磷酸合成酶、亞硫酸鹽氧化酶、ATP合酶、醛脫氫酶和NADH脫氫酶表達(dá)量增加,而丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、脂酰輔酶A脫氫酶和鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量降低。實(shí)驗(yàn)表明,腎陽虛動物能量代謝相關(guān)酶的變化與腎陽虛的臨床虛寒癥狀有關(guān)。綜上所述,由于蛋白質(zhì)組的很多特征如整體性、動態(tài)性、時空性、復(fù)雜性等與中醫(yī)“證”的特點(diǎn)十分吻合,而且具有特異性,以蛋白質(zhì)組學(xué)為切入點(diǎn)進(jìn)行“證”實(shí)質(zhì)研究在現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究中具有明顯的優(yōu)勢,目