nk1受體阻滯劑對電針大鼠內(nèi)關(guān)穴抗ami損傷效應(yīng)的自主神經(jīng)及中樞sp、nos的影響

nk1受體阻滯劑對電針大鼠內(nèi)關(guān)穴抗ami損傷效應(yīng)的自主神經(jīng)及中樞sp、nos的影響

通過相關(guān)實驗，p物質(zhì)和氧化氮基因（nos）是電針內(nèi)關(guān)穴抗急性心肌缺血（acutionianacademyclovac細胞（pmi）損傷效應(yīng)的重要物質(zhì)。劉強等研究提示心臟和內(nèi)關(guān)穴區(qū)的神經(jīng)纖維有一部分來自脊神經(jīng)節(jié)和迷走神經(jīng)節(jié)中的同一個神經(jīng)元。這為電針內(nèi)關(guān)穴抗AMI損傷與心自主神經(jīng)參與提供了有力依據(jù)。由于SP廣泛分布于心血管中樞,為探討SP在自主神經(jīng)及其中樞對電針內(nèi)關(guān)穴抗AMI損傷效應(yīng)中的作用機制,擬開展本實驗。由于NK1受體對SP最敏感,是中樞SP作用的主要受體,NK1受體阻滯劑能透過血腦屏障,因此本實驗選擇靜脈注射NK1受體阻滯劑,觀察電針內(nèi)關(guān)穴對AMI大鼠自主神經(jīng)作用效應(yīng)及中樞SP、NOS陽性表達,進一步分析SP在內(nèi)關(guān)-心臟相關(guān)中的作用。1材料表面1.1實驗動物SD大鼠30只,體重180～200g,雌雄不拘,由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供,普通級,動物合格證號:610103。1.2聚氨基四氮唑藍的合成100μL,購自CHENICONINTNATIONAL(AM.);即用型SABC免疫組化染色試劑盒:購自武漢博士德生物公司;NADPHNa4:25mg,購自Biosharp(AM.);3-3-DAB.4HCl(3-3二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽):1g,購自Amresco,由薈萃生物公司提供;氯化硝基四氮唑藍:250mg,購自科瑞生物公司(上海,英國分裝);NK1受體阻滯劑:L-703606,5mg,FW598.5,SIGMA。2方法2.1股靜脈采血試驗20%烏拉坦給于大鼠腹腔注射麻醉(5mL/kg),按6U/kg比例股靜脈注入垂體后葉素(pituitary,Pit)注射液(6U/mL,蚌埠市宏業(yè)生化制藥廠,批號020612)觀察心電圖在1min內(nèi)出現(xiàn)心率明顯減慢、T波顯著高聳,或ST段抬高>0.1mV為造模成功。2.2神經(jīng)節(jié)的分離交感神經(jīng)放電記錄大鼠麻醉后手術(shù)臺仰臥固定,頸部剪毛,碘伏消毒,在喉頭與胸骨間沿頸正中線作長約2.5～4cm的切口,尋找右側(cè)頸動脈鞘(內(nèi)有頸動脈及迷走神經(jīng))后,分離出迷走神經(jīng)主干約1～2cm,并以4號線從中間引出備用;在左側(cè)頸總動脈后、椎前肌淺面、椎體旁,將椎前筋膜用玻璃分針縱向剝離,找出頸交感干,沿交感干向下找出頸下神經(jīng)節(jié),用細線穿過神經(jīng)下方引出備用。將分離的右側(cè)迷走神經(jīng)、左側(cè)交感神經(jīng)分別掛上BL-420E+生理儀(成都,泰盟)銀絲電極,記錄神經(jīng)放電情況,記錄中石蠟油濕潤神經(jīng),記錄時間25min。2.3小鼠海馬的組織病理學(xué)檢測切片打開大鼠胸腔,經(jīng)升主動脈插管,先用0.9%Nacl注射液100mL快速灌注,后用4%多聚甲醛的0.1mol/LPBS液(Ph7.4)400mL先快速、后緩慢灌注固定50～60min。灌注完畢立即取完整腦組織及C7～T7段脊髓放入上述相同的新鮮固定液中固定4h,再移入25%蔗糖溶液過夜沉底(4℃),次日取出組織作恒冷箱連續(xù)冠狀切片,片厚40μm。按大鼠腦定位圖譜,留海馬出現(xiàn)至海馬傘體積最大顯示之間切片20張/只;切取延髓第四腦室至中央導(dǎo)水管段留片20張/只;切取脊髓C8～T2段留片20張/只。上述切片0.01mol/LKPBS液4℃保存。2.4sp抗體-igg-sp-100-u切片漂洗(入0.01mol/LKPBS液漂洗10min×3次,下同);浸入80%甲醇雙氧水(雙氧水濃度為0.3%)30min(4℃),漂洗;入含0.3%TritonX-100的0.01mol/L的KPBS緩沖液搖床30min;入SP抗體(稀釋濃度1:1000)4℃孵育48h,漂洗;入生物素化羊抗兔IgG(稀釋濃度1:0)4℃孵育12h,漂洗;入SABC復(fù)合水(釋濃度1:0)4℃孵育12h,漂洗;顯色,漂洗;貼片\干燥;脫水;明膠封片。2.5u3000結(jié)論切片漂洗;入含0.3%TritonX-100的0.01mol/LKPBS緩沖液搖床30min,漂洗;入孵育液(硝基四氮唑藍2mg溶入含0.3%TritonX-100的0.01mol/LKPBS液10ml中,抽出1ml加入NADPH1mg,37℃2h),漂洗;貼片\干燥;脫水;明膠封片。2.6神經(jīng)放電檢測SD大鼠30只,隨機分為正常組(A組)、模型對照組(B組)、電針內(nèi)關(guān)組(C組)、阻滯劑組(D組)、阻滯劑+電針內(nèi)關(guān)組(E組),每組6只。各組處理方法如下:正常組(A組):分離神經(jīng)、記錄神經(jīng)放電,分別于第0min、3min、8min、13min、23min標(biāo)記,之后脊髓、腦固定并取材、切片,檢測SP、NOS。模型對照組(B組):分離神經(jīng)、記錄神經(jīng)放電,第3min造模,分別于造模前、造模后0min、5min、10min、20min標(biāo)記,之后組織固定、取材、切片、檢測同A組。電針內(nèi)關(guān)組(C組):分離神經(jīng)、記錄神經(jīng)放電,造模、標(biāo)記同B組,造模后5min針刺左上肢內(nèi)關(guān)穴(參照華興邦“大鼠穴位圖譜”,于尺骨、橈骨縫間離腕關(guān)節(jié)約3mm處取“內(nèi)關(guān)”穴,毫針0.38mm×15mm)并接G6805-1型電針儀,疏密波(8～80Hz,疏密波轉(zhuǎn)換14次/min,電壓1.5V,強度1mA),電針5min后去電針儀繼續(xù)留針至15min起針。最后組織固定、取材、切片、檢測同A組。阻滯劑組(D組):在記錄交感神經(jīng)及迷走神經(jīng)放電前30min左側(cè)股靜脈注入NK1受體阻滯劑(250nmol/kg),其余操作同模型對照組(B組)。阻滯劑+電針內(nèi)關(guān)組(E組):在記錄交感神經(jīng)及迷走神經(jīng)放電前30min左側(cè)股靜脈注入NK1受體阻滯劑(250nmol/kg),其余操作同電針內(nèi)關(guān)組(C組)。2.7免疫組化法測入射光度值觀察各組造模前,造模后0、5、10、20min各時刻迷走神經(jīng)及交感神經(jīng)放電頻率(Hz)。依據(jù)國外文獻報道,當(dāng)所記錄的峰電位波幅大于基礎(chǔ)干擾波波幅2倍以上時,可認為是有效放電,各時刻后1min內(nèi)10次采樣,每次采樣時長1s,累加取均值。觀測PVN、延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)及脊髓外側(cè)角SP、NOS灰度值。運用圖像分析系統(tǒng)測定其灰度值是對其免疫組化結(jié)果進行量化評價的一種方法,即入射光灰度和它穿過免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物后的灰度之比的對數(shù)值,紅光光密度與其含量呈正比,而綠光和藍光與其含量呈反比。由于SP免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色,因此,SP光密度值與其含量呈正比,而NOS免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈藍色,故NOS光密度與其含量呈反比。3sp、nos免疫陽性基于實驗的大鼠血清pn、c8木納格、c8木馬立克氏體免疫陽性sp、c82sp或nos免疫陽性增加值sp、nos免疫陽性增加值sp、nos免疫定量見表1圖像分析采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)進行,對棕黃色和藍色雜交信號進行灰度掃描。每鼠取下丘腦室旁核(PVN)、延髓迷走神經(jīng)背核、C8～T2各4張,每片于相應(yīng)部位取3個視野,每項指標(biāo)共12個視野,分別測定,累加取均值,即為該鼠SP或NOS免疫陽性灰度值。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,組內(nèi)比較、組間比較采用SPSS12.0軟件進行方差分析,顯著性標(biāo)準為0.05。4結(jié)果4.1肌活檢神經(jīng)放電頻率從表1可以看出,造模后各時刻迷走神經(jīng)放電頻率B組與造模前及A組相應(yīng)時刻相比顯示差異性(P<0.05),C組造模后0min與造模前及A組放電頻率也顯示差異性(P<0.05),均提示心肌缺血造模后引起迷走神經(jīng)放電頻率增加;C組造模后20min(即電針內(nèi)關(guān)結(jié)束)迷走神經(jīng)放電頻率降低,與組內(nèi)造模前及A組同時刻比較無差異,與同時刻B組相比有差異性(P<0.05),提示電針內(nèi)關(guān)穴對急性心肌缺血引起的迷走神經(jīng)放電有抑制效應(yīng)。造模前,D、E組與A組放電頻率相比,組間無差異;造模后0～20min,D、E組放電頻率增加,與A組比較有差異性(P<0.05),提示SP受體阻滯劑對AMI大鼠迷走神經(jīng)的興奮未造成明顯影響;E與C組在造模后10、20min組間比較有差異性(P<0.05),提示NK1受體阻滯劑影響了電針內(nèi)關(guān)穴對AMI的保護效應(yīng)。4.2電針內(nèi)關(guān)穴對ami引起的單次入射電特性的影響從表2可以看出,B、C組造模后交感神經(jīng)放電頻率與造模前及A組同時刻相比顯示差異性(P<0.05),提示心肌缺血造模后引起交感神經(jīng)放電頻率增加;C組造模后20min(即電針內(nèi)關(guān)結(jié)束)交感神經(jīng)放電頻率增加,與組內(nèi)造模前及A組相應(yīng)時間段無差異,與同時刻B組相比有差異性(P<0.05),提示電針內(nèi)關(guān)穴對AMI引起的交感神經(jīng)放電有興奮效應(yīng)。造模前,D、E組與A組放電頻率相比,組間無差異;造模后0～20min,D、E組放電頻率降低,與A組比較顯示出組間差異性(P<0.05)。D、E組各時刻組間無明顯差異,E與C組在造模后10、20min組間比較有差異性(P<0.05),提示NK1受體阻滯劑影響了電針內(nèi)關(guān)對交感神經(jīng)興奮未產(chǎn)生明顯增強效應(yīng)。4.3sp陽性表達從表3可以看出,B組各部位SP灰度值小于A組,組間比較有差異性(P<0.05);C組各部位SP灰度值均高于A、B組,組間比較有差異性(P<0.05),提示AMI造模后,PVN、延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)、脊髓外側(cè)區(qū)由于SP釋放而降低,經(jīng)電針內(nèi)關(guān)穴處理上述三部位的SP表達增高;D、E組各部位SP灰度值低于A組,組間有差異性(P<0.05),與NK1受體阻滯劑干預(yù)后三部位SP陽性表達降低有關(guān);與C組比較,E組三部位SP灰度值低,組間有差異性(P<0.05),提示E組電針內(nèi)關(guān)處理未提高三部位SP陽性表達。4.4造模前后nos含量的變化從表4可以看出,B組各部位NOS灰度值最大,與A、C組間均顯示出差異性(P<0.05),由于NOS光密度與其含量呈反比,提示造模后NOS在三部位含量減少,電針內(nèi)關(guān)治療能上調(diào)三部位的NOS的含量;D組與A組比較,三部位NOS灰度值較高,組間有差異性(P<0.05);E組與C組各部位比較,組間均顯示出差異性(P<0.05),提示NK1受體阻滯劑對電針內(nèi)關(guān)上調(diào)NOS表達起到了阻斷作用。5sp、nos變化情況一般認為,延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)(包括迷走神經(jīng)背核、孤束核)是支配心自主神經(jīng)的中樞部位。下丘腦室旁核(PVN)通過下丘腦下行通路使PVN、延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)、脊髓外側(cè)角等部位聯(lián)系起來,在心血管功能活動中起到整合作用。近年來研究表明,神經(jīng)肽類物質(zhì)如P物質(zhì)(SP)和神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮(NO)均參與心血管功能活動的重要調(diào)節(jié)。NOS是NO生成過程中的最重要的限速因子,是NO合成的關(guān)鍵酶,因此檢測組織中的NOS可反映NO生成的情況。SP、NO作為調(diào)節(jié)心血管活動的重要物質(zhì),伴隨自主神經(jīng)抗AMI損傷作用過程,研究中樞SP、NO如何發(fā)揮作用效應(yīng)及二者之間關(guān)系對于探討內(nèi)關(guān)-心臟相關(guān)有重要意義。通過實驗發(fā)現(xiàn),心肌缺血時,迷走神經(jīng)放電頻率增加、抑制交感神經(jīng)放電,致使心率減慢,此時自主神經(jīng)中樞PVN、延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)、脊髓外側(cè)角各部位SP、NOS含量減少,電針內(nèi)關(guān)穴處理后迷走神經(jīng)放電頻率降低,交感神經(jīng)放電頻率增高,自主神經(jīng)中樞PVN、延髓迷走神經(jīng)復(fù)合區(qū)、脊髓外側(cè)角各部位SP、NOS含量增加,提示電針內(nèi)關(guān)穴抗AMI保護效應(yīng)與心自主神經(jīng)調(diào)