下丘腦室旁核胃動素與胃運動調(diào)節(jié)

下丘腦室旁核胃動素與胃運動調(diào)節(jié)

胃動素是一種含有22個氨基酸的多媒體矩陣，主要從腸道頂部的嗜鉻細胞（ec2）排出，并在消化間轉(zhuǎn)化。根據(jù)文獻，腹部胃運動的惡化與血漿中胃動素濃度的變化規(guī)律一致。血漿胃素濃度的變化與各種因素有關(guān)。其中之一是十二指腸腔的ph值。根據(jù)研究，一些部落的人和豬通過磺酸脫水產(chǎn)生胃動素。近年來有文獻報道,除消化道外,胃動素還廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),包括大腦皮層、下丘腦、小腦、垂體及松果體,但對于中樞胃動素參與的作用及其機制尚未明了。本工作旨在探討下丘腦室旁核內(nèi)胃動素神經(jīng)元的存在和外源性胃動素注入室旁核對胃運動的影響及其機制。1材料和方法1.1胃動素免疫陽性細胞的免疫組織化學染色1.1.1動物實驗前飲食實驗選用Wistar大鼠20只,雌雄兼?zhèn)?體重200～300g,隨機分為四組,每組5只:正常飲食組(對照組)、饑餓組、灌酸組、及手術(shù)對照組。正常飲食組實驗前正常飲食,不作任何處理;饑餓組大鼠實驗前禁食18～24h,自由飲水;灌酸組動物實驗前自由飲食,在胃十二指腸連接處將一直徑2mm管插入十二指腸(遠端結(jié)扎),灌入0.1N鹽酸1ml,保留5min后斷頭取腦;手術(shù)對照組實驗前自由飲食,在胃十二指腸連接處將一直徑2mm管插入十二指腸(遠端結(jié)扎),灌入生理鹽水1ml,保留5min后斷頭取腦。1.1.2中性紅在pbs和abc染色法四組動物斷頭取腦后,所需腦段(前囟至前囟后3mm)入4%多聚甲醛固定2h,PBS沖洗組織,20%蔗糖浸泡過夜(4℃)。作額狀面連續(xù)冰凍切片,厚15μm,用ABC染色法顯示,中性紅輕度復(fù)染,陰性對照以PBS代替第一抗體,其余步驟相同。(所用胃動素抗體由比利時安特衛(wèi)普大學Timmermans教授提供。)1.1.3每隔麻黃取張數(shù)。每隔張數(shù)每只大鼠取5張切片計數(shù)室旁核胃動素神經(jīng)元陽性細胞數(shù)(每隔四張取一張)。每張切片在室旁核陽性細胞密集處觀察4個互不重疊的高倍鏡視野計數(shù)陽性細胞,4個視野陽性細胞數(shù)總和為該切片室旁核的陽性細胞數(shù)。1.2動物腦段內(nèi)甲醛微核試驗實驗選用Wistar大鼠8只,雌雄兼?zhèn)?體重200～300g。8%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后,固定在腦立體定位儀上,參照Paxinos-Waston圖譜,迷走背核的坐標為:A12.8mm,R0.9mm,H8.1mm,用尖端內(nèi)徑50μm的微玻管緩慢注入30%HRP(購自PromegoRZ>3.0)溶液0.2μl,動物存活40～48h后,經(jīng)左心室-升主動脈插管,先快速灌注生理鹽水50ml,隨后慢灌注500ml4%甲醛,切取相關(guān)腦段(前囟至前囟后3mm)置入4%甲醛固定2h,20%蔗糖浸泡12～24h(4℃)。冰凍切片40μm,按Mesulam的TMB呈色反應(yīng)。用1%中性紅染液復(fù)染。明暗視野顯微鏡(BX-50,OLYMPUS)下觀察。1.3大鼠胃運動的記錄1.3.1術(shù)后觀察及實驗分組實驗用Wistar大鼠34只,雌雄兼?zhèn)?體重200～300g。手術(shù)前禁食18～24h,自由飲水,8%水合氯醛(400mg/kg)麻醉,將記錄胃平滑肌收縮運動的自制應(yīng)力傳感器縫在距幽門十二指腸連接處0.5cm處的胃竇漿膜上,導(dǎo)線通過頸背部伸出。將大鼠頭部固定在腦立體定位儀上,按照Paxinos-Waston圖譜室旁核坐標為:A1.8mm,R0.5mm,H8mm。將直徑2mm的外套管植入,以502膠和牙托粉固定,外套管中植入內(nèi)芯,防止堵塞。術(shù)后每天腹腔給予青霉素鈉2萬單位以預(yù)防感染。術(shù)后3d可進行實驗。記錄前動物禁食18～24h,自由飲水,給藥前先觀察60min胃運動,待記錄平穩(wěn)后,室旁核微量注射胃動素0.37nmol/L(n=8)、或CCK-80.043nmol/L(n=6)(左或右側(cè)),注射量為0.5μl,觀察胃運動頻率和幅度的變化。對照組注射生理鹽水。(胃動素由比利時魯汶大學胃腸激素研究室Peeters教授提供;CCK由美國匹茲堡大學Verbalis教授提供)行膈下迷走神經(jīng)切斷術(shù)的動物(n=12),術(shù)后5d進行實驗。實驗組(n=6)微量注射胃動素,對照組(n=6)注射生理鹽水,注射量及記錄時間均與前述迷走神經(jīng)完整組一致。實驗結(jié)束后,動物經(jīng)心臟以生理鹽水和4%甲醛灌注固定腦部,作50μm系列冠狀切片,觀察腦內(nèi)套管軌跡,確定注射位置是否準確。1.3.2計算結(jié)果統(tǒng)計計算給藥后胃收縮波頻率及振幅指數(shù)(單位時間內(nèi)收縮波振幅總和)較給藥前收縮波頻率及振幅指數(shù)的變化百分數(shù),計算公式為:1.4統(tǒng)計處理實驗結(jié)果均以均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間差異顯著性采用t檢驗方法。2結(jié)果2.1免疫組化檢測在正常對照組下丘腦的室旁核、視上核、弓狀核、腹外側(cè)核、腹內(nèi)側(cè)核等區(qū)域均發(fā)現(xiàn)有胃動素免疫陽性細胞,陽性細胞胞漿染色均勻,呈棕黃色,細胞膜上及胞漿內(nèi)有棕色反應(yīng)顆粒。饑餓組和灌酸組的室旁核胃動素免疫陽性細胞數(shù)明顯增多(圖1～3),與對照組相比均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01,表1)。2.2hrp標記細胞迷走背核注入0.2μlHRP后40～48h,觀察到室旁核有HRP標記細胞,細胞漿內(nèi)有粗大的呈黑色顆粒的TMB反應(yīng)產(chǎn)物,標記細胞同側(cè)較多,主要在小細胞部,大細胞部較少(圖4)。2.3在室外邊緣的輔助下，微注入胃動素可能會影響大鼠的胃運動2.3.1胃收縮頻率變化率室旁核注入胃動素可使胃的收縮幅度及頻率增大,持續(xù)10min(圖5)。胃收縮幅度變化率在5min內(nèi)為25.97%±21.84%(P<0.01);在5～10min內(nèi)為52.65%±26.04%(P<0.05)。胃收縮頻率變化率由于標準差比均數(shù)大故改用非參數(shù)檢驗,在5min內(nèi)T=0,P<0.02;在5～10min內(nèi)T=3,P<0.05。2.3.2動減弱后胃收縮情況大鼠室旁核注入CCK-8可引起大鼠胃運動減弱,胃收縮幅度降低,持續(xù)5min(圖5),其變化率為-29.57%±8.1%(P<0.05),頻率變化無統(tǒng)計意義。2.3.3室旁核胃動素的影響大鼠行膈下迷走神經(jīng)切斷術(shù),5d后重復(fù)3.1實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn):室旁核胃動素增強胃運動的效應(yīng)消失,注藥后胃運動幅度和幅度的變化率與生理鹽水組比均無統(tǒng)計意義(P>0.05)。3室旁核內(nèi)胃動素為大鼠胃運動調(diào)節(jié)機制的作用據(jù)文獻報道,內(nèi)源性胃動素的釋放受神經(jīng)體液因素的影響,蛙皮素、阿片肽等可促進血漿胃動素濃度的增加,胃動素本身也可使血漿胃動素的濃度增高。Thomas和Jacobowitz在1981年用免疫熒光和免疫組化的方法分別報道了在下丘腦的視前區(qū)和終板血管器(OVLT)中有較高濃度的胃動素。近年來發(fā)現(xiàn),側(cè)腦室注入胃動素有增加小鼠攝食和抗焦慮的作用本室的研究工作表明,下丘腦胃動素有增強胃運動的作用,本實驗的免疫組化結(jié)果顯示,下丘腦室旁核內(nèi)存在胃動素免疫陽性細胞,在機體處于饑餓狀態(tài)或十二指腸內(nèi)酸性增高的情況下,核團內(nèi)胃動素免疫陽性細胞數(shù)明顯增多,表明下丘腦室旁核內(nèi)胃動素神經(jīng)元的活動受來自消化道傳入信息的影響。由此推測,下丘腦胃動素可能是參與胃運動調(diào)節(jié)機制的組成部分。下丘腦是內(nèi)分泌及植物神經(jīng)調(diào)控中樞,是消化機能傳入傳出信息的重要轉(zhuǎn)換站。有研究表明,電解毀損室旁核及其周圍區(qū)對大鼠攝食、飲水有影響,損毀室旁核尾側(cè)后可引起動物過食和肥胖。已證實室旁核除含加壓素和催產(chǎn)素神經(jīng)元外,還含有多種可興奮或抑制胃運動的多肽,如膽囊收縮素(CCK)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素(CRH)、促甲狀腺激素釋放激素(TRH)、神經(jīng)降壓素(NT)等。已知外周血漿胃動素濃度為10-10～10-11mol/L,為了證明室旁核內(nèi)胃動素可能參與中樞對胃運動的調(diào)節(jié)作用,我們以生理劑量(3.7×10-11mol/L)的胃動素注入室旁核內(nèi),觀察到清醒大鼠胃運動明顯增強。以往的文獻證實,中樞內(nèi)存在有CCK及其受體并能抑制胃運動,我們的實驗也證實,室旁核內(nèi)CCK具有抑制胃運動的作用?？梢娤虑鹉X室旁核是此兩類腦腸肽實現(xiàn)其對胃運動興奮或抑制作用的重要核團。下丘腦與延髓的內(nèi)臟運動與感覺中樞有密切關(guān)系,本實驗辣根過氧化物酶逆行追蹤工作中觀察到,迷走背核內(nèi)注入HRP后4