ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)及c-fos表達(dá)的影響

ghrelin對(duì)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)及c-fos表達(dá)的影響

網(wǎng)絡(luò)發(fā)布時(shí)間：2014-07-221817。Ghrelin是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(growthhormonesecretagoguereceptor,GHS-R)的內(nèi)源性配體,是由28個(gè)氨基酸組成的小分子多肽,在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有分布。Ghrelin受體的激活可發(fā)揮多種生理學(xué)作用,可刺激胃酸分泌和胃排空,加快小腸蠕動(dòng),改善術(shù)后腸梗阻癥狀。我們近來研究也發(fā)現(xiàn),ghrelin可促進(jìn)大鼠消化間期復(fù)合肌電活動(dòng),但關(guān)于ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響很少有研究。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)和腸神經(jīng)系統(tǒng)(entericnervoussystem,ENS)在胃腸運(yùn)動(dòng)中起著重要作用。以往研究發(fā)現(xiàn),ghrelin可通過中樞和外周機(jī)制促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng),然而關(guān)于其具體作用機(jī)制的研究很少見報(bào)道。新近研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射ghrelin導(dǎo)致大鼠攝食增加,下丘腦弓狀核、室旁核的c-Fos表達(dá)增加。腦室和室旁核注入ghrelin可促進(jìn)大鼠攝食,增加與攝食相關(guān)核團(tuán),如下丘腦室旁核、背內(nèi)側(cè)核、弓狀核、延髓孤束核和最后區(qū)的c-Fos表達(dá)。然而靜脈注射ghrelin還可以增加哪些腦區(qū)的c-Fos表達(dá),是否可增加與促消化道動(dòng)力相關(guān)的核團(tuán)的c-Fos表達(dá),是否能增加脊髓的c-Fos表達(dá),目前尚不清楚。靜脈注射ghrelin對(duì)完整消化道c-Fos表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)觀察了靜脈給予ghrelin對(duì)大鼠消化道和上述腦區(qū)c-Fos表達(dá)的影響,重點(diǎn)分析了與促消化道運(yùn)動(dòng)相關(guān)核團(tuán)的c-Fos表達(dá)的變化,并觀察了受體拮抗劑對(duì)ghrelin作用的影響,為闡明并進(jìn)一步研究ghrelin的促動(dòng)力機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康SD大鼠,雌雄不拘,體質(zhì)量220~240g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2大鼠rp-6和grtelinGhrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6由美國Anaspec公司提供,兔抗鼠c-Fos抗體由美國SantaCruz公司提供,Ghrelin由美國鳳凰生物制品有限公司提供。1.3小鼠腸轉(zhuǎn)染率的檢測(cè)①埋置十二指腸導(dǎo)管。大鼠禁食18h,腹腔注射100g/L水合氯醛400mg/kg麻醉,外科無菌操作下沿腹正中線剪開腹壁肌肉以及腹膜,用18G針頭在十二指腸距幽門1cm處刺入腸腔,將一根聚乙烯導(dǎo)管(外徑1.0mm,內(nèi)徑0.7mm)經(jīng)穿刺孔置入十二指腸腔內(nèi),導(dǎo)管在腸腔內(nèi)留置約1cm,用絲線將導(dǎo)管縫合固定。在右上腹和肩胛間區(qū)之間做皮下隧道,將導(dǎo)管固定于體外,以防鼠咬損壞。用大頭針封住導(dǎo)管的露出端。術(shù)后大鼠分籠單獨(dú)清潔飼養(yǎng),恢復(fù)1周可用于實(shí)驗(yàn)。②小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)量。實(shí)驗(yàn)大鼠隨即分為5組(n=8),禁食24h,分別經(jīng)尾靜脈給予ghrelin(2、5、10、20μg/kg,溶于0.3mL生理鹽水)。對(duì)照組給予0.3mL生理鹽水。經(jīng)靜脈給予藥物或生理鹽水后,經(jīng)十二指腸導(dǎo)管注入0.1mL伊文氏藍(lán)溶液(50mg/mL溶于生理鹽水中)。用0.1mL生理鹽水沖洗導(dǎo)管,以保證導(dǎo)管內(nèi)的染料均進(jìn)入十二指腸。20min后,脫頸椎處死大鼠,立即打開腹腔,用絲線扎緊幽門和回盲瓣,剪取上端自幽門、下端至回盲瓣的腸管。仔細(xì)分離腸系膜,將小腸擺放成直線。避免拉伸小腸,以防止腸內(nèi)容物流動(dòng)。測(cè)量從幽門到回盲瓣的腸管長(zhǎng)度為“小腸總長(zhǎng)度”,從幽門至染料移行的前沿為“染料移行長(zhǎng)度”,計(jì)算小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率(%)=[染料移行長(zhǎng)度(cm)/小腸總長(zhǎng)度(cm)]×100%。為觀察ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6在ghrelin促小腸轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用,經(jīng)尾靜脈給予(D-Lys3)GHRP-6(0.37mg/kg),10min后再給予ghrelin(20μg/kg),觀察小腸轉(zhuǎn)運(yùn)變化,方法同上。1.4grt-pcr聯(lián)合grtp-6治療k-gh3-5e的藥物治療大鼠每組6只,分別經(jīng)頸靜脈注入ghrelin,生理鹽水,生理鹽水+ghrelin,(D-Lys3)GHRP-6+ghrelin。上述藥物劑量為ghrelin20μg/kg,ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-60.37mg/kg。注射藥物后大鼠禁食,自由飲水,90min后用100g/L水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉。經(jīng)左心室穿刺至主動(dòng)脈,用生理鹽水快速?zèng)_血管,用40g/L多聚甲醛緩沖液經(jīng)升主動(dòng)脈灌注。開顱取腦和胸腰段脊髓,分別剪取胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸,生理鹽水沖凈,經(jīng)多聚甲醛緩沖液后固定8h,20~30g/L蔗糖溶液梯度脫水,液氮速凍后,組織包埋劑包埋,恒冷冰凍切片機(jī)切片。1.5c-fos抗體構(gòu)建采用SABC法進(jìn)行c-Fos免疫組織化學(xué)染色。腦片采用漂染法,胃腸組織切片采用片染法。胃腸組織切片在PBS中浸泡5min,采用微波修復(fù)(高火3min,再小火10min),晾至室溫。腦片在PBS中浸泡5min,再和修復(fù)后的切片一起用稀鹽酸泡30min,以使細(xì)胞核形態(tài)清楚。PBS洗10min×3次,30mL/LTritonX-100室溫孵育40min,PBS漂洗5min×3次,30mL/LH2O2室溫孵育30min,PBS漂洗10min×3次。正常山羊血清封閉(37℃,90min),兔抗鼠c-Fos抗體孵育(1∶500,4℃42h)。PBS漂洗20min×3次,生物素標(biāo)記羊抗兔IgG孵育(4℃18h),PBS漂洗20min×3次。ABC復(fù)合物孵育(37℃30min),PBS漂洗20min×3次,DAB顯色,PBS沖洗終止反應(yīng)。腦片進(jìn)行裱片、晾干,再和胃腸組織切片一起脫水、透明、封片。用0.01mol/LPBS代替第一抗體做陰性對(duì)照。1.6c-fos陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)共選取14個(gè)中樞核團(tuán)或亞核進(jìn)行分析,其中包括GHS-R分布較多的部位以及對(duì)消化道功能有重要調(diào)控作用的核團(tuán)。對(duì)每只大鼠每個(gè)核團(tuán)的c-Fos陽性細(xì)胞記數(shù)時(shí),必須在相同平面選擇6張腦片,胸腰段脊髓選取20張脊髓片計(jì)數(shù),在高倍鏡下結(jié)合Paxinos-Waston圖譜分別數(shù)兩側(cè)核團(tuán),算出平均值(在室旁核給藥時(shí)數(shù)一側(cè)室旁核)。胃腸道c-Fos陽性細(xì)胞的記數(shù)采用每只大鼠選取6張切片,每張切片在高倍鏡下隨機(jī)數(shù)5個(gè)視野,算出平均值。1.7方差分析結(jié)果結(jié)果采用ue0af±s表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析(SPSS13.0軟件),組間比較采用LSD-t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn),方差齊同,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1[小鼠轉(zhuǎn)運(yùn)率]對(duì)照組大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為(62.7±6.2)%。與對(duì)照組相比,靜脈給予ghrelin2μg/kg時(shí)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(70.2±6.4)%,P>0.05],給予ghrelin5μg/kg[小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率(73.7±7.1)%,P<0.05],10μg/kg[小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為(75.5±6.9)%,P<0.01]和20μg/kg[小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為(80.9±8.5)%,P<0.001]呈劑量依賴性地促進(jìn)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。Ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6單獨(dú)應(yīng)用對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)有抑制作用[小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率為(52.6±7.6)%,P<0.05],與ghrelin聯(lián)合應(yīng)用則顯著阻斷了其促動(dòng)力作用[轉(zhuǎn)運(yùn)率為(65.7±7.2)%,P<0.05,圖1]。2.2c.n-pcr中pahs-mtn-medalus,u-pas,cornu-solitact,spinlus,dcmsc-Fos的免疫反應(yīng)陽性為胞核呈黃色或深棕色,胞質(zhì)無表達(dá)。我們的研究發(fā)現(xiàn),生理鹽水對(duì)照組大鼠的c-Fos表達(dá)很少,而給大鼠靜脈注射ghrelin后可誘導(dǎo)CNS內(nèi)廣泛部位的c-Fos表達(dá),最突出的部位是下丘腦室旁核(periventricularnucleus,PVN)、弓狀核(arcuatenucleus,ARC)、杏仁內(nèi)側(cè)核(medialamygdaloidnucleus,Me)、迷走神經(jīng)背核(dorsalmotornucleusofvagus,DMN)、孤束核(nucleusofsolitarytract,NTS)、延髓最后區(qū)(areapostrema,AP)及胸腰段脊髓背角(cornudorsalemedullaespinalis,CDMS)(圖2、圖3)。然而,下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedialhypothalamicnucleus,VMH)、下丘腦背內(nèi)側(cè)核(dorsomedialhypothalamicnucleus,DMH)、外側(cè)區(qū)(lateralhypothalamicarea,LH)、海馬(hippocamp,HIP)、杏仁中央核(centralamygdaloidnucleus,CeA)、杏仁基底外側(cè)核(basolateralnucleusoftheamygdala,BL)及腦橋臂旁核(parabrachialnucleus,PBN)均未見表達(dá)。2.3射grtelin單次給藥對(duì)大鼠胃、瞳金叢c-fos表達(dá)的影響鹽水對(duì)照組大鼠的胃腸道腸神經(jīng)叢c-Fos表達(dá)很少,甚至沒有表達(dá)。靜脈注射ghrelin不同程度地增加了大鼠胃、十二指腸、空腸和近端結(jié)腸的腸神經(jīng)叢的c-Fos表達(dá),其中以胃和近端結(jié)腸的c-Fos表達(dá)最為顯著(圖4、圖5)。回腸、盲腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸的c-Fos表達(dá)與對(duì)照組相比無顯著差異。2.4grt-pcr中c-fos的表達(dá)核團(tuán)靜脈給予ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6后再給予ghrelin,觀察腦內(nèi)各核團(tuán)的c-Fos表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)所選取的核團(tuán)為靜脈給予ghrelin后c-Fos表達(dá)增加的核團(tuán),包括下丘腦室旁核、弓狀核、迷走神經(jīng)背核,孤束核、延髓最后區(qū),胸腰段脊髓背角、杏仁內(nèi)側(cè)核。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6不同程度地抑制了ghrelin激活的中樞各核團(tuán)c-Fos的表達(dá),即c-Fos表達(dá)明顯減少(表1)。2.5腸神經(jīng)叢的選擇靜脈給予(D-Lys3)GHRP-6后再給予ghrelin,觀察腸神經(jīng)叢的c-Fos表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)選取的腸神經(jīng)叢為靜脈給予ghrelin后c-Fos表達(dá)增加的腸神經(jīng)叢,包括胃、十二指腸、空腸和近端結(jié)腸腸神經(jīng)叢。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6不同程度地抑制了ghrelin激活的胃腸神經(jīng)叢c-Fos表達(dá),即c-Fos表達(dá)均明顯減少(表2)。3grtelin調(diào)控腸道c-fos基因Ghrelin作為新近發(fā)現(xiàn)的腦腸肽,其生理作用及其機(jī)制也越來越受到重視。新近研究發(fā)現(xiàn),ghrelin可加速胃排空、增加胃酸分泌及促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)。目前,關(guān)于ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響很少有研究。FUKUDA等通過觀察ghrelin對(duì)大鼠胃排空和小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,提出ghrelin可能通過內(nèi)在的神經(jīng)通路和對(duì)辣椒辣素敏感的感覺傳入神經(jīng)系統(tǒng)促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng),但沒有研究量效關(guān)系和ghrelin受體拮抗劑的作用。并且FUKUDA等采用將Na51CrO4灌入大鼠胃中的方法來觀察小腸轉(zhuǎn)運(yùn),這受到胃排空的影響,并不是單獨(dú)的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)。我們的實(shí)驗(yàn)通過在大鼠十二指腸埋置導(dǎo)管,經(jīng)導(dǎo)管注入伊文氏藍(lán)來觀察ghrelin對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,并建立量效曲線,觀察了ghrelin受體拮抗劑的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),靜脈注射ghrelin可促進(jìn)大鼠小腸轉(zhuǎn)運(yùn),并呈劑量依賴性關(guān)系,ghrelin受體拮抗劑(D-Lys3)GHRP-6顯著阻斷ghrelin的促動(dòng)力作用。BRON等通過原位雜交等方法證實(shí)ghrelin受體GHS-R存在于大鼠的下丘腦、延髓、心臟、胃腸道等處。DASS和XU等利用熒光免疫組織化學(xué)方法在人、大鼠和豚鼠的胃和結(jié)腸也發(fā)現(xiàn)ghrelin及其受體。然而,ghrelin調(diào)控胃腸運(yùn)動(dòng)的具體機(jī)制尚不明確,研究其對(duì)神經(jīng)元的作用則十分必要。C-Fos基因是一種即刻早期基因,被稱為核內(nèi)“第三信使”。在生理情況下,大多數(shù)細(xì)胞中有很低水平的c-Fos表達(dá)。在藥物、電刺激及缺血等情況下,c-Fos表達(dá)可在數(shù)分鐘或數(shù)十分鐘內(nèi)顯著增多。因此,c-Fos的表達(dá)可作為神經(jīng)元受刺激后激活的標(biāo)志。MASUDA等發(fā)現(xiàn)靜脈注射ghrelin0.8~20μg/kg可刺激胃酸分泌和胃排空。FUJINO等證實(shí)靜脈注射ghrelin4~40μg/kg均可促進(jìn)禁食期間的胃腸動(dòng)力。我們以往的研究也發(fā)現(xiàn),ghrelin20μg/kg可顯著增強(qiáng)消化間期胃腸的肌電活動(dòng)。因此,本實(shí)驗(yàn)選定20μg/kg為觀察ghrelin對(duì)胃腸道c-Fos表達(dá)變化的靜脈給藥量,認(rèn)為其為促進(jìn)胃腸動(dòng)力的有效劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,靜脈注射ghrelin可增加下丘腦室旁核、弓狀核和杏仁內(nèi)側(cè)核的c-Fos表達(dá),同時(shí)增加迷走神經(jīng)背側(cè)復(fù)合體(dorsalvagalcomplex,DVC)(包括迷走神經(jīng)背核、孤束核及最后區(qū))、胸腰段脊髓背角的c-Fos表達(dá);臂旁核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核及海馬等處的c-Fos表達(dá)也有增加,但與對(duì)照組相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用ghrelin受體拮抗劑顯著減弱了ghrelin的作用。然而,RUTER等研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射ghrelin不能增加DVC的c-Fos表達(dá)。我們的研究與此有差異,這可能是由于靜脈和腹腔兩種給藥途徑不同所致,或由于尚不明確的其他因素(如給藥劑量不同或大鼠種屬不同)。下丘腦和腦干是調(diào)節(jié)機(jī)體功能的兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)。下丘腦與其他腦區(qū)有復(fù)雜而廣泛的纖維聯(lián)系,它不僅通過神經(jīng)和血管途徑調(diào)節(jié)腦垂體前、后葉激素的分泌和釋放,而且還參與調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng),如控制水鹽代謝、調(diào)節(jié)體溫、攝食、睡眠等內(nèi)臟活動(dòng)以及情緒等。已有研究證實(shí)下丘腦的弓狀核和室旁核參與CNS對(duì)胃腸道功能的調(diào)節(jié)。腦干的主要功能是維持個(gè)體生命,包括心跳、呼吸、消化、體溫、睡眠等重要生理功能。腦干與下丘腦有密切聯(lián)系,腦干的孤束核神經(jīng)元可發(fā)出纖維直接投射到達(dá)下丘腦,同時(shí)也可接受下丘腦的下行投射。腦干的DVC,可將來自脊髓的神經(jīng)沖動(dòng)傳至大腦,是腦腸軸的中樞整合部位。本研究發(fā)現(xiàn),靜脈注射ghrelin使下丘腦核團(tuán)和腦干DVC的c-Fos表達(dá)增加,提示下丘腦核團(tuán)參與了ghrelin的生物學(xué)作用,腦干參與ghrelin的信息傳遞。然而,c-Fos陽性細(xì)胞在一些核團(tuán)的分布與GHS-R的分布并不完全一致。例如,在下丘腦外側(cè)區(qū)、海馬CA3和CA4區(qū)和杏仁基底內(nèi)側(cè)核的GHS-R分布很豐富,但卻缺乏c-Fos表達(dá)。我們推測(cè)ghrelin對(duì)這些核團(tuán)c-Fos的激活可能需要其他因子的參與(至少對(duì)c-Fos來說),或者通過除GHS-R之外的受體發(fā)揮其功能。靜脈注射ghrelin使下丘腦室旁核和弓狀核的cFos表達(dá)顯著增多。以往研究表明,GHS-R在室旁核和弓狀核上均有廣泛表達(dá),ghrlein在弓狀核也有較多表達(dá)。弓狀核是表達(dá)許多攝食相關(guān)神經(jīng)肽的感受器,如瘦素及ghrelin。弓狀核神經(jīng)纖維聯(lián)系十分廣泛,與室旁核、腹內(nèi)側(cè)核、孤束核等都有豐富的纖維投射,除了在攝食調(diào)節(jié)和能量平衡中起重要作用外,還直接參加消化道運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)節(jié)。室旁核接受來自弓狀核的神經(jīng)纖維,兩者共同參與中樞對(duì)攝食、能量代謝、胃腸活動(dòng)等的調(diào)控。由于弓狀核位于血腦屏障之外,可以直接接受來自外周的傳入信號(hào),我們推測(cè)靜脈注射的ghrelin還有可能直接作用于弓狀核上的GHS-R,