鮑曼不動(dòng)桿菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)步驟

鮑曼不動(dòng)桿菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)操作程序生物安全警告：所操作菌為條件致病菌，請(qǐng)按二級(jí)生物安全水平操作，轉(zhuǎn)移和操作活菌時(shí)更要注意。處理大量菌株，請(qǐng)?jiān)谏锇踩裰羞M(jìn)行。以正確方式對(duì)接觸培養(yǎng)物的塑料制品和玻璃制品進(jìn)行消毒或丟棄。開(kāi)始操作之前，請(qǐng)閱讀所有指導(dǎo)。把所有接觸過(guò)細(xì)胞懸液或凝膠塊的塑料制品、玻璃制品、吸管、小鏟等當(dāng)作污染材料，按照實(shí)驗(yàn)室的生物要求丟棄或消毒。可重復(fù)使用的制膠模具須在清洗前消毒；可丟棄的制膠模具及膠帶和用來(lái)把凝膠塊從樣品孔中推出的小片，應(yīng)該用10%漂白劑消毒30分鐘以上，然后清洗和重復(fù)使用。提前準(zhǔn)備從檢測(cè)培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（或相當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基）上培養(yǎng)；用同一個(gè)接種針/環(huán)，穿刺或接種于小螺帽管中半固體培養(yǎng)基，以保證必要時(shí)重復(fù)檢測(cè)同一個(gè)克隆。37°C培養(yǎng)14-18小時(shí)。第一天1、 打開(kāi)水浴搖床（54C）、水浴箱（56C）。2、 用TE緩沖液（具體試劑配制方法見(jiàn)附件）制備1%SeakemGold：1%SDS瓊脂糖，以配制25ml體積為例說(shuō)明，方法如下：1） 準(zhǔn)確稱取0.25gSeaKemGoldagarose,放入250ml的藍(lán)色瓶?jī)?nèi)。2） 加入22.5mlTE緩沖液，輕柔搖蕩瓶子使瓊脂均勻散開(kāi)。3）微松瓶蓋，將玻璃瓶放于微波爐內(nèi)高火加熱30秒，取出輕柔搖蕩，再次加熱30秒，重復(fù)操作直至瓊脂徹底溶解（無(wú)顆粒物、懸浮物，透光均一，無(wú)明顯異常折光，無(wú)氣泡）。4） 將溶解的SeaKemGoldagarose放入56C（55-60C均可）水浴箱內(nèi)全少15分鐘，再加入預(yù)熱到56C的10%SDS溶液2.5ml，置于56C水浴箱備用。3、 在Falcon2054管（或其他相當(dāng)?shù)墓埽┥蠘?biāo)記樣品名稱和空白對(duì)照；在1.5ml微量離心管上標(biāo)記好對(duì)應(yīng)樣品的名稱。4、 在Falcon2054管中分別加入約2ml細(xì)胞懸濁液CSB（配制方法見(jiàn)附件）。注：使用測(cè)定細(xì)菌濃度的容器不同加入CSB的量也不同。5、 用CSB濕潤(rùn)棉簽，從培養(yǎng)皿上刮取適量細(xì)菌，均勻懸濁于CSB中。通過(guò)加入CSB稀釋或增加菌量提高濃度，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至指定范圍。用比濁儀（bioMerieuxVitekcolorimeter）測(cè)其濃度，并調(diào)整濃度至3.0-3.5麥?zhǔn)蠁挝?。注：?.0?3.5該范圍內(nèi)細(xì)菌的濃度都可得到較滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但過(guò)大的濃度差距會(huì)造成同一塊膠上的條帶亮度差異，影響條帶的識(shí)別。6、 取400閆細(xì)菌懸濁液于相應(yīng)的1.5ml微量離心管中，置于37°C水浴中孵育5分鐘。將剩余的細(xì)菌懸濁液置于冰上直到膠塊制備完畢。7、 從水浴箱中取出微量離心管，每管加入20M蛋白酶K（儲(chǔ)存液濃度20mg/ml）混勻，使其終濃度為0.5mg/ml，蛋白酶K置于冰上備用。注：蛋白酶K的終濃度是指在加入400M瓊脂后的濃度。8、加入400M的1%SeakemGold：1%SDS到上述裝有400M細(xì)菌懸液的微量離心管內(nèi)，用槍頭輕輕混勻，避免有氣泡產(chǎn)生。（此時(shí)1%SeakemGold：1%SDS需置于56C水浴中）注：沒(méi)有用完的SeakemGoldagarose可放于室溫，并可重復(fù)使用1-2次。再溶時(shí)，加熱時(shí)間縮短到每10-15秒一次，直至完全溶解。9、 迅速將混合物加入模具，避免氣泡產(chǎn)生，在室溫下凝固10-15分鐘。為節(jié)省時(shí)間也可以在4C下凝固5分鐘。10、 記錄好模具內(nèi)對(duì)應(yīng)樣品的名稱。細(xì)菌的裂解1、 在50ml離心管上做好樣品標(biāo)記。注：相同菌株的膠條可以同時(shí)放于同一個(gè)管中裂解，最多不要超過(guò)4條。2、 配制細(xì)胞裂解液CLB（配制方法見(jiàn)附件），然后向每5ml細(xì)胞裂解液加入25M蛋白酶K（20mg/ml），使其終濃度為0.1mg/ml，然后顛倒混勻。注：蛋白酶K要置于冰上，配制好的蛋白酶K/CLB混合液也要置于冰上。建議配制總量后進(jìn)行分裝。3、 每個(gè)離心管加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。4、 如果想使膠塊平齊，可以用刀片削去模具表面多余的部分。打開(kāi)可重復(fù)利用模具，用小鏟將膠塊推入上述裂解混合液中。保證膠塊在液面下，而不在管壁上。注：剩余的菌液以及其它使用過(guò)的器具應(yīng)丟棄并消毒?？芍貜?fù)利用模具需要浸于泡騰片消毒液中15分鐘，然后清洗干凈。5、 將離心管放在54°C水浴搖床中孵育2小時(shí)，轉(zhuǎn)速約130轉(zhuǎn)/分鐘。確認(rèn)水浴箱內(nèi)液面高于離心管內(nèi)裂解混合液的液面。6、 將純水和TE放在50C水浴箱中預(yù)熱。清洗膠塊1、 調(diào)低水浴搖床的溫度至50C。2、 從水浴搖床中拿出裝有膠條的離心管，蓋上濾蓋，輕輕倒掉CLB，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上輕磕管底使膠塊落在管底。注：可將離心管倒置在吸水紙上，使管內(nèi)液體被盡量排凈。隨后的操作中也如此。3、 每管中加入10ml預(yù)熱的TYPEONEWATER。確保膠塊在液面下而不在管壁或注：TYPEONEWATER是水質(zhì)達(dá)到18.2M歐的純水經(jīng)高壓滅菌后得到的，清洗膠塊以及配置TE緩沖液時(shí)均需使用TYPEONEWATERo4、 放回50C水浴搖床中，轉(zhuǎn)速約130轉(zhuǎn)/分鐘，搖10分鐘。5、 倒掉水，用TYPEONEWATER再洗一次。6、 倒掉水，加入10ml預(yù)熱的TE，在50C的水浴搖床中搖15分鐘。7、 倒掉TE，用TE重復(fù)洗三次，每次10-15分鐘。8、 倒掉丁￡，加入10mlTE，放在4C冰箱保存?zhèn)溆?。注：要確保膠塊在液面下而不在管壁或蓋子上。第二天膠塊內(nèi)DNA的酶切1、 在1.5ml離心管上標(biāo)記好相應(yīng)的樣品及H9812的名稱。注：H9812為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株，其Xba1酶切片斷可用于分子量標(biāo)準(zhǔn)2、 按照下面的比例配制緩沖液M的緩沖體系，并混勻。試劑M/膠塊M/11膠塊純水160M1760mBufferM20閆220閆BSA20閆220閆總體積200M2200m注：緩沖液要置于冰上。不同試劑供應(yīng)商，相同試劑供應(yīng)商的不同酶切緩沖液是不通用的，所以應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明來(lái)配制緩沖體系，這里以TaKaRa為例。3、 在每個(gè)1.5ml微量離心管中加入200閆緩沖液。4、 小心地從TE中取出膠塊放在干凈的培養(yǎng)皿上。5、 用刀片切下約2mm寬的膠塊放入1.5ml微量離心管中。確保膠塊在液面下面。將剩余的膠塊放回原來(lái)的TE中。6、 將試管放在37°C水浴中孵育10-15分鐘。7、 在用稀釋緩沖液孵育的過(guò)程中，按照以下比例配制酶切反應(yīng)體系，混勻。試劑M/膠塊M/11膠塊純水157m1727mBufferM20閆220mBSA20閆220mApaI(15U/M)3閆33閆總體積200m2200m注：將酶置于冰上，用后立即放在一20C保存。8、 用槍頭吸出緩沖液M，避免損傷膠塊。9、 每管加入200閆混合液，輕輕在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上磕管子的底部，確保膠塊在液面的下面。10、 在37C水浴中孵育至少2小時(shí)。加樣1、 打開(kāi)水浴箱，溫度調(diào)至55-60C。2、 配制2200ml的0.5XTBE。3、 用0.5XTBE配制1%SeaKemGold（SKG）膠。14cm寬電泳膠框（10-15加樣孔）：1.0gSKG膠溶于100ml0.5XTBE中;21cm寬電泳膠框（N15加樣孔）：1.5gSKG膠溶于150ml0.5XTBE中。4、熔化時(shí)，微波加熱60秒，混合；每隔15-30秒重復(fù)一次，直到膠完全熔化。放在55-60°C水浴箱備用（溫度至少平衡30分鐘以后使用）。5、 調(diào)整梳子高度，使梳子齒與膠槽的底面相接觸。用水平儀調(diào)整膠槽使其水平。6、 從37C水浴中取出膠塊，平衡到室溫。7、 用槍頭吸出酶切混合液，避免損傷或吸出膠塊。8、 每管加入200閆0.5XTBE，室溫平衡3分鐘。9、 把梳子平放在膠槽上，把膠塊加在梳子齒上。把標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812上樣在第1、5、10個(gè)齒上（10齒梳子）或第1、5、10、15個(gè)齒上（15齒梳子）。10、 用吸水紙的邊緣吸去膠塊附近多余的液體，在室溫下風(fēng)十約3分鐘。11、 把梳子放入膠槽，確保所有的膠塊在一條線上，并且膠塊與膠槽的底面相接觸。從膠槽的下部中央緩慢到入100ml熔化的在55C—60C平衡的1%SKG。避免氣泡的生成；如果有，用槍頭消除。在室溫下凝固30分鐘。10、記錄加樣順序。電泳條件1、 確保電泳槽是水平的。如果不水平，調(diào)整槽底部的旋鈕。注：不要觸碰電極。2、 加入2-2.2L0.5XTBE，關(guān)上蓋子。3、 打開(kāi)主機(jī)和泵的開(kāi)關(guān)，確保泵設(shè)在一70（這時(shí)緩沖液的流速約1L/分鐘）和緩沖液在管道中正常循環(huán)。4、 打開(kāi)冷凝機(jī)，確保預(yù)設(shè)溫度在14C（緩沖液達(dá)到該溫度通常約需要20分鐘）。5、 打開(kāi)膠槽的旋鈕，取出凝固好的膠，用吸水紙清除膠四周和底面多余的膠，小心的把膠放入電泳槽，關(guān)上蓋子。6、 設(shè)置電泳參數(shù)。Initialswitchtime=5.0secondsFinalswitchtime=20.0seconds，線性，電壓6V/cm。電泳時(shí)間為19小時(shí)啟動(dòng)“StartRun”第三天圖像的獲取1、 結(jié)束電泳：關(guān)機(jī)順序?yàn)椋豪淠龣C(jī)一泵一主機(jī)。2、 取出膠，放在盛放400mlEB溶液的托盤(pán)內(nèi)。注：EB儲(chǔ)存液濃度為10mg/ml，1：10,000稀釋，即在400ml水中加入40閆儲(chǔ)存液EB是強(qiáng)致畸劑。儲(chǔ)存在棕色瓶中的EB稀釋液可以用10次左右。廢棄的EB溶液應(yīng)妥善處理。可選用毒性小的GelRed染劑做代替。3、 將托盤(pán)放在搖床上搖25-30分鐘。4、 放掉電泳槽中的TBE,用2L純水清洗電泳