巴西橡膠樹單染色體分離及其高通量測序分析的研究

煤炭及含硫模型化合物生物降解轉(zhuǎn)化的研究專業(yè)：礦物加工工程姓名：邵雪嫚導(dǎo)師：張明旭教授安徽理工大學(xué)13級碩士研究生學(xué)位論文答辯報(bào)告報(bào)告主要內(nèi)容課題來源立題依據(jù)國內(nèi)外研究進(jìn)展本研究的目的和意義研究內(nèi)容研究方法和技術(shù)路線預(yù)期目標(biāo)新穎之處所需解決的主要問題研究基礎(chǔ)和條件研究進(jìn)度及經(jīng)費(fèi)預(yù)算選題背景最近幾年，由于煤炭的降解機(jī)理與降解酶有著直接的關(guān)系，所以煤炭的生物降解研究主要集中在白腐菌所產(chǎn)生的一系列降解酶，由此也聯(lián)想到通過提高酶活性和產(chǎn)酶量來達(dá)到高降解轉(zhuǎn)化率的目的。一般來說，MnP氧化大部分酚類、胺類等底物，LiP與其互為補(bǔ)充，氧化相對應(yīng)的物質(zhì)，而漆酶不僅可以氧化胺類物質(zhì)也可氧化酚類物質(zhì)[9,10]。微生物降解煤中有機(jī)硫研究已經(jīng)取得很大的進(jìn)展[11-12]，其中研究最多的屬嗜硫菌對模型化合物DBT的降解，并且其確定了4S途徑的降解機(jī)理[13]，對于其他含硫模型化合的研究較少，因此本課題研究了DBTO2的脫硫情況。1.課題來源基于基因工程構(gòu)建煤炭降解工程菌降解轉(zhuǎn)化煤炭的機(jī)理研究(51374014)

生物酶脫除煤炭中有機(jī)硫的機(jī)理研究（51474012）2.立題依據(jù)

橡膠是我國重要的戰(zhàn)略物資。國內(nèi)外已從橡膠中克隆了近420種基因或cDNA，然而這些基因基本均是從橡膠樹cDNA文庫或其總基因組中獲得，無法確定其在橡膠樹染色體上的位置和分布特點(diǎn)，從而導(dǎo)致無法進(jìn)一步確定其所在的連鎖群。研究者也先后發(fā)表了利用各種分子標(biāo)記構(gòu)建的橡膠樹連鎖遺傳圖，但均是從總基因組中獲得，并存在著不同程度的連鎖群不穩(wěn)定，豐度小而且分布不均勻，許多功能基因在染色體組上的連鎖關(guān)系和位置都不清楚，直接利用分子標(biāo)記輔助橡膠樹育種難度較大。3.國內(nèi)外研究進(jìn)展目前木質(zhì)素降解酶已成為國內(nèi)研究的熱點(diǎn)，石開儀等人發(fā)現(xiàn)白腐真菌通過Lac和Lip的催化作用可以使百里酚脫酚基、脫甲基、開環(huán)、氧化等。何寶燕、尹華、彭輝等人研究了黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)對十溴聯(lián)苯醚(BDE209)的降解；發(fā)現(xiàn)在含1mg/LBDE209的降解體系中，生物量為1.74g降解率達(dá)到最大(86.76%)；盧永等利用黃抱原毛平革菌對焦化廢水進(jìn)行降解研究，找到了降解的最優(yōu)條件[19]；曾斌等研究了白腐真菌對五氯酚的降解情況[20]；這些都為進(jìn)一步探索微生物對有機(jī)物的降解打下了基礎(chǔ)。

研究內(nèi)容

（1）紫外誘變對黃孢原毛平革菌酶活性的影響以及酶活性與降解率之間的關(guān)系。（2）微波誘變后的誘變菌的酶活性變化以及對低階煤的降解狀況。（3）紫外，微波處理的球紅假單胞菌對DBT的降解狀況及最適誘變時(shí)間。（4）利用響應(yīng)面處理的方法探索影響DBT降解效果的因素。（5）球紅假單胞菌對其他含硫模型化合物的降解。創(chuàng)新點(diǎn)

（1）目前，對于利用紫外、微波誘變方法，篩選誘變菌種已做了大量的研究工作，但是這兩種處理方法對降解酶系的活性和產(chǎn)量有無影響，以及降解酶活性與降解轉(zhuǎn)化率之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步探索。（2）球紅菌可以降解轉(zhuǎn)化DBT已被我們所熟知，但是紫外或是微波處理后的菌種對其降解效果還未被探究。（3）球紅菌對其他的含硫模型化合有無降解能力，降解效果如何，降解產(chǎn)物具體是那些等問題還未被探究。（4）首次利用響應(yīng)面的方法探索了球紅菌降解DBT的影響因素的最佳組合（5）結(jié)合生物酶提純技術(shù)，首次探索了紫外，微波誘變處理后降解酶的濃度變化與酶活性變化。.

已發(fā)表的采用高通量測序的植物全基因組De

nove測序:

黃瓜(Cucumissativus)（HuangS等,2009）蘋果(MalusdomesticaBorkh)(VelascoR等,2010)野生大豆(Glycinesoja)(KimMY等,2010)森林草莓（ShulaevV等,2011)、可可樹(ArgoutX等,2011)麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)(SatoS等,2011)棗椰樹(Phoenixdactylifera)(Al-DousEK等,2011)馬鈴薯(Solanumtuberosum)(XuX等,2011)白菜(Brassicarapa)(WangX等,2011)大麻(Cannabissativa)(vanBakelH等,2011)木豆(Cajanuscajan)(VarshneyRK等,,2012)蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)(YoungN等,2011)

橡膠樹的全基因組De

nove測序目前還為發(fā)布。在植物方面對植物單條染色體進(jìn)行高通量測序僅在小麥的單條染色體臂（聶小軍等,2013）的研究中有過報(bào)道，在橡膠樹中尚未見報(bào)道。

基因組測序只能測出整個(gè)DNA的堿基對排列順序，不能直接測出DNA上的基因及其功能，必須通過生物信息學(xué)方法，結(jié)合蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對測出來的序列進(jìn)行分析，將基因及其功能加以挖掘、注釋，這稱作基因注釋。基因組注釋主要包括四個(gè)研究方向：重復(fù)序列的識別；非編碼RNA的預(yù)測；基因結(jié)構(gòu)預(yù)測和基因功能注釋。在國內(nèi)外在植物方面已有對花生(陳華等,2009)、水稻(王宏斌等,2010)、大豆(王茵茵等,2010)、杜仲(李鐵柱,2012)、構(gòu)樹(彭建軍,2013)，擬南芥(張翔,2012,2013)等進(jìn)行基因注釋的相關(guān)報(bào)道。在橡膠樹上的基因注釋比較少。4.本研究目的和意義

本研究采用顯微玻璃針分離技術(shù)對巴西橡膠樹部分染色體進(jìn)行單染色體顯微分離，再利用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增法對橡膠樹部分單染色體進(jìn)行體外擴(kuò)增，并對其第二輪PCR產(chǎn)物采用Illumina/Solexa高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序，進(jìn)而對相應(yīng)染色體的序列進(jìn)行序列分析、功能注釋，從而進(jìn)一步明確橡膠樹已知的重要功能基因和預(yù)測功能的基因在橡膠樹染色體組上的位置，初步對現(xiàn)有的橡膠樹連鎖群進(jìn)行歸類。

本項(xiàng)目可為篩選橡膠樹染色體特異片段、單染色體或其區(qū)段的特異探針或特異標(biāo)記，為構(gòu)建橡膠樹單條染色體功能基因的分離和定位及基因組物理圖譜構(gòu)建提供有效工具，從而有效的應(yīng)用于橡膠樹分子輔助育種。5.研究內(nèi)容5.1巴西橡膠樹熱研7-33-97單染色體分離技術(shù)體系的建立。

主要通過借助顯微操作儀的玻璃針分離法，進(jìn)行巴西橡膠樹熱研7-33-97部分單條染色體分離和技術(shù)體系的優(yōu)化。5.2單條染色體體外擴(kuò)增與鑒定

采用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增法對已分離出的巴西橡膠樹染色體進(jìn)行體外擴(kuò)增，通過Southern雜交鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物來自巴西橡膠樹基因組，經(jīng)熒光原位雜交（FISH)驗(yàn)證并結(jié)合核型分析確定染色體序號。5.3巴西橡膠樹單染色體PCR產(chǎn)物高通量測序與序列的功能注釋

對已鑒定的單染色體第二輪的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Illumina/Solexa高通量測序，并對測序結(jié)果通過相應(yīng)生物信息學(xué)分析進(jìn)行其功能注釋。如單條染色體測得的序列片段進(jìn)行編號、片段大小分析，通過BLAST在線進(jìn)行各橡膠樹序列與基因庫中橡膠樹已知功能基因或未知基因序列比對，進(jìn)一步明確橡膠樹重要功能基因在橡膠樹染色體組上的位置，同時(shí)對同源染色體的序列進(jìn)行比對，進(jìn)而分析同源染色體之間在DNA水平上可能存在的差異等。6.研究方法與技術(shù)路線6.1實(shí)驗(yàn)材料

本研究的主要實(shí)驗(yàn)材料是：黃孢原毛平革菌，球紅假單胞菌，DBT。6.2研究方法1紫外誘變（1）首先打開紫外燈預(yù)熱30min穩(wěn)定光波取制備好的孢子懸液各6ml于9ml的平板培養(yǎng)平皿中，放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊照射控制照射距離30cm。輻射處理時(shí)間梯度為：0s；20s；40s；80s；120s；160s；200s；250s。所有操作必須在紅燈下進(jìn)行，照射后的菌體不可直接接到平板培養(yǎng)基上，必須轉(zhuǎn)入無菌試管中并立即放入無光照的冰水中1-2h，防止細(xì)胞修復(fù)，影響實(shí)驗(yàn)效果。（2）取上述誘變處理的菌懸液0.5ml均勻涂布于平板固體培養(yǎng)基上，四天后觀察菌落生長狀況，圖片記錄。將上述各自生長狀況良好的菌落同上制成106/ml的孢子懸液，接1ml菌懸液于50ml的發(fā)酵液中，搖床培養(yǎng)7天后，分別取10ml樣品裝入小錐形瓶，加入各種酶提取用緩沖溶液（LiP采用緩沖液A，MnP采用緩沖液B，漆酶采用100mmol/L的醋酸鈉緩沖液，PH5.0）振蕩提取1h，150rpm。離心（4200rpm,20min），取上清液用0.45um濾膜過濾，濾液用于測定酶活。2微波誘變打開微波爐，選取中檔功率，取制備好的106/ml孢子懸液30ml與錐形