巴西橡膠樹(shù)單染色體分離及其高通量測(cè)序分析的研究

煤炭及含硫模型化合物生物降解轉(zhuǎn)化的研究專業(yè)：礦物加工工程姓名：邵雪嫚導(dǎo)師：張明旭教授安徽理工大學(xué)13級(jí)碩士研究生學(xué)位論文答辯報(bào)告報(bào)告主要內(nèi)容課題來(lái)源立題依據(jù)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展本研究的目的和意義研究?jī)?nèi)容研究方法和技術(shù)路線預(yù)期目標(biāo)新穎之處所需解決的主要問(wèn)題研究基礎(chǔ)和條件研究進(jìn)度及經(jīng)費(fèi)預(yù)算選題背景最近幾年，由于煤炭的降解機(jī)理與降解酶有著直接的關(guān)系，所以煤炭的生物降解研究主要集中在白腐菌所產(chǎn)生的一系列降解酶，由此也聯(lián)想到通過(guò)提高酶活性和產(chǎn)酶量來(lái)達(dá)到高降解轉(zhuǎn)化率的目的。一般來(lái)說(shuō)，MnP氧化大部分酚類、胺類等底物，LiP與其互為補(bǔ)充，氧化相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)，而漆酶不僅可以氧化胺類物質(zhì)也可氧化酚類物質(zhì)[9,10]。微生物降解煤中有機(jī)硫研究已經(jīng)取得很大的進(jìn)展[11-12]，其中研究最多的屬嗜硫菌對(duì)模型化合物DBT的降解，并且其確定了4S途徑的降解機(jī)理[13]，對(duì)于其他含硫模型化合的研究較少，因此本課題研究了DBTO2的脫硫情況。1.課題來(lái)源基于基因工程構(gòu)建煤炭降解工程菌降解轉(zhuǎn)化煤炭的機(jī)理研究(51374014)

生物酶脫除煤炭中有機(jī)硫的機(jī)理研究（51474012）2.立題依據(jù)

橡膠是我國(guó)重要的戰(zhàn)略物資。國(guó)內(nèi)外已從橡膠中克隆了近420種基因或cDNA，然而這些基因基本均是從橡膠樹(shù)cDNA文庫(kù)或其總基因組中獲得，無(wú)法確定其在橡膠樹(shù)染色體上的位置和分布特點(diǎn)，從而導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)一步確定其所在的連鎖群。研究者也先后發(fā)表了利用各種分子標(biāo)記構(gòu)建的橡膠樹(shù)連鎖遺傳圖，但均是從總基因組中獲得，并存在著不同程度的連鎖群不穩(wěn)定，豐度小而且分布不均勻，許多功能基因在染色體組上的連鎖關(guān)系和位置都不清楚，直接利用分子標(biāo)記輔助橡膠樹(shù)育種難度較大。3.國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展目前木質(zhì)素降解酶已成為國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)，石開(kāi)儀等人發(fā)現(xiàn)白腐真菌通過(guò)Lac和Lip的催化作用可以使百里酚脫酚基、脫甲基、開(kāi)環(huán)、氧化等。何寶燕、尹華、彭輝等人研究了黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)對(duì)十溴聯(lián)苯醚(BDE209)的降解；發(fā)現(xiàn)在含1mg/LBDE209的降解體系中，生物量為1.74g降解率達(dá)到最大(86.76%)；盧永等利用黃抱原毛平革菌對(duì)焦化廢水進(jìn)行降解研究，找到了降解的最優(yōu)條件[19]；曾斌等研究了白腐真菌對(duì)五氯酚的降解情況[20]；這些都為進(jìn)一步探索微生物對(duì)有機(jī)物的降解打下了基礎(chǔ)。

研究?jī)?nèi)容

（1）紫外誘變對(duì)黃孢原毛平革菌酶活性的影響以及酶活性與降解率之間的關(guān)系。（2）微波誘變后的誘變菌的酶活性變化以及對(duì)低階煤的降解狀況。（3）紫外，微波處理的球紅假單胞菌對(duì)DBT的降解狀況及最適誘變時(shí)間。（4）利用響應(yīng)面處理的方法探索影響DBT降解效果的因素。（5）球紅假單胞菌對(duì)其他含硫模型化合物的降解。創(chuàng)新點(diǎn)

（1）目前，對(duì)于利用紫外、微波誘變方法，篩選誘變菌種已做了大量的研究工作，但是這兩種處理方法對(duì)降解酶系的活性和產(chǎn)量有無(wú)影響，以及降解酶活性與降解轉(zhuǎn)化率之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步探索。（2）球紅菌可以降解轉(zhuǎn)化DBT已被我們所熟知，但是紫外或是微波處理后的菌種對(duì)其降解效果還未被探究。（3）球紅菌對(duì)其他的含硫模型化合有無(wú)降解能力，降解效果如何，降解產(chǎn)物具體是那些等問(wèn)題還未被探究。（4）首次利用響應(yīng)面的方法探索了球紅菌降解DBT的影響因素的最佳組合（5）結(jié)合生物酶提純技術(shù)，首次探索了紫外，微波誘變處理后降解酶的濃度變化與酶活性變化。.

已發(fā)表的采用高通量測(cè)序的植物全基因組De

nove測(cè)序:

黃瓜(Cucumissativus)（HuangS等,2009）蘋果(MalusdomesticaBorkh)(VelascoR等,2010)野生大豆(Glycinesoja)(KimMY等,2010)森林草莓（ShulaevV等,2011)、可可樹(shù)(ArgoutX等,2011)麻風(fēng)樹(shù)(Jatrophacurcas)(SatoS等,2011)棗椰樹(shù)(Phoenixdactylifera)(Al-DousEK等,2011)馬鈴薯(Solanumtuberosum)(XuX等,2011)白菜(Brassicarapa)(WangX等,2011)大麻(Cannabissativa)(vanBakelH等,2011)木豆(Cajanuscajan)(VarshneyRK等,,2012)蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)(YoungN等,2011)

橡膠樹(shù)的全基因組De

nove測(cè)序目前還為發(fā)布。在植物方面對(duì)植物單條染色體進(jìn)行高通量測(cè)序僅在小麥的單條染色體臂（聶小軍等,2013）的研究中有過(guò)報(bào)道，在橡膠樹(shù)中尚未見(jiàn)報(bào)道。

基因組測(cè)序只能測(cè)出整個(gè)DNA的堿基對(duì)排列順序，不能直接測(cè)出DNA上的基因及其功能，必須通過(guò)生物信息學(xué)方法，結(jié)合蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對(duì)測(cè)出來(lái)的序列進(jìn)行分析，將基因及其功能加以挖掘、注釋，這稱作基因注釋?；蚪M注釋主要包括四個(gè)研究方向：重復(fù)序列的識(shí)別；非編碼RNA的預(yù)測(cè)；基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和基因功能注釋。在國(guó)內(nèi)外在植物方面已有對(duì)花生(陳華等,2009)、水稻(王宏斌等,2010)、大豆(王茵茵等,2010)、杜仲(李鐵柱,2012)、構(gòu)樹(shù)(彭建軍,2013)，擬南芥(張翔,2012,2013)等進(jìn)行基因注釋的相關(guān)報(bào)道。在橡膠樹(shù)上的基因注釋比較少。4.本研究目的和意義

本研究采用顯微玻璃針?lè)蛛x技術(shù)對(duì)巴西橡膠樹(shù)部分染色體進(jìn)行單染色體顯微分離，再利用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增法對(duì)橡膠樹(shù)部分單染色體進(jìn)行體外擴(kuò)增，并對(duì)其第二輪PCR產(chǎn)物采用Illumina/Solexa高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而對(duì)相應(yīng)染色體的序列進(jìn)行序列分析、功能注釋，從而進(jìn)一步明確橡膠樹(shù)已知的重要功能基因和預(yù)測(cè)功能的基因在橡膠樹(shù)染色體組上的位置，初步對(duì)現(xiàn)有的橡膠樹(shù)連鎖群進(jìn)行歸類。

本項(xiàng)目可為篩選橡膠樹(shù)染色體特異片段、單染色體或其區(qū)段的特異探針或特異標(biāo)記，為構(gòu)建橡膠樹(shù)單條染色體功能基因的分離和定位及基因組物理圖譜構(gòu)建提供有效工具，從而有效的應(yīng)用于橡膠樹(shù)分子輔助育種。5.研究?jī)?nèi)容5.1巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97單染色體分離技術(shù)體系的建立。

主要通過(guò)借助顯微操作儀的玻璃針?lè)蛛x法，進(jìn)行巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97部分單條染色體分離和技術(shù)體系的優(yōu)化。5.2單條染色體體外擴(kuò)增與鑒定

采用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增法對(duì)已分離出的巴西橡膠樹(shù)染色體進(jìn)行體外擴(kuò)增，通過(guò)Southern雜交鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)自巴西橡膠樹(shù)基因組，經(jīng)熒光原位雜交（FISH)驗(yàn)證并結(jié)合核型分析確定染色體序號(hào)。5.3巴西橡膠樹(shù)單染色體PCR產(chǎn)物高通量測(cè)序與序列的功能注釋

對(duì)已鑒定的單染色體第二輪的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Illumina/Solexa高通量測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果通過(guò)相應(yīng)生物信息學(xué)分析進(jìn)行其功能注釋。如單條染色體測(cè)得的序列片段進(jìn)行編號(hào)、片段大小分析，通過(guò)BLAST在線進(jìn)行各橡膠樹(shù)序列與基因庫(kù)中橡膠樹(shù)已知功能基因或未知基因序列比對(duì)，進(jìn)一步明確橡膠樹(shù)重要功能基因在橡膠樹(shù)染色體組上的位置，同時(shí)對(duì)同源染色體的序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而分析同源染色體之間在DNA水平上可能存在的差異等。6.研究方法與技術(shù)路線6.1實(shí)驗(yàn)材料

本研究的主要實(shí)驗(yàn)材料是：黃孢原毛平革菌，球紅假單胞菌，DBT。6.2研究方法1紫外誘變（1）首先打開(kāi)紫外燈預(yù)熱30min穩(wěn)定光波取制備好的孢子懸液各6ml于9ml的平板培養(yǎng)平皿中，放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊照射控制照射距離30cm。輻射處理時(shí)間梯度為：0s；20s；40s；80s；120s；160s；200s；250s。所有操作必須在紅燈下進(jìn)行，照射后的菌體不可直接接到平板培養(yǎng)基上，必須轉(zhuǎn)入無(wú)菌試管中并立即放入無(wú)光照的冰水中1-2h，防止細(xì)胞修復(fù)，影響實(shí)驗(yàn)效果。（2）取上述誘變處理的菌懸液0.5ml均勻涂布于平板固體培養(yǎng)基上，四天后觀察菌落生長(zhǎng)狀況，圖片記錄。將上述各自生長(zhǎng)狀況良好的菌落同上制成106/ml的孢子懸液，接1ml菌懸液于50ml的發(fā)酵液中，搖床培養(yǎng)7天后，分別取10ml樣品裝入小錐形瓶，加入各種酶提取用緩沖溶液（LiP采用緩沖液A，MnP采用緩沖液B，漆酶采用100mmol/L的醋酸鈉緩沖液，PH5.0）振蕩提取1h，150rpm。離心（4200rpm,20min），取上清液用0.45um濾膜過(guò)濾，濾液用于測(cè)定酶活。2微波誘變打開(kāi)微波爐，選取中檔功率，取制備好的106/ml孢子懸液30ml與錐形