污水處理廠活性污泥微生物的研究

污水處理廠活性污泥微生物的研究

活著的泥漿是污水處理廠暴露池中有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化的主體。其生物活性的根本上決定了污水處理廠的污水處理能力，活性廢水的生物活性主要取決于微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能?；钚晕勰嘀械奈⑸镏饕杉?xì)菌、放線菌、真菌以及原生動(dòng)物和后生動(dòng)物等構(gòu)成,其中細(xì)菌是最主要成分。因此,活性污泥微生物菌群研究一直是環(huán)境科學(xué)、生態(tài)學(xué)和環(huán)境工程等領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。20世紀(jì)80年代之前,活性污泥菌群的研究主要以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法為主。該方法從活性污泥中發(fā)現(xiàn)的主要優(yōu)勢菌群有:動(dòng)膠桿菌屬(Zoogloea)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobcter)、螺菌屬(Spirillum)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、短桿菌屬(Brevibacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等。但是后來大量研究發(fā)現(xiàn),在活性污泥中經(jīng)典純培養(yǎng)方法能夠培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量只占活性污泥微生物總數(shù)的1%～15%。因此,對(duì)活性污泥菌群新研究方法的探索是20世紀(jì)80年代的當(dāng)務(wù)之急。20世紀(jì)80年代后期,隨著以16SrRNA為主要基石的細(xì)菌分子分類學(xué)的發(fā)展,PCR技術(shù)、電泳技術(shù)、克隆文庫技術(shù)、熒光原位雜交(FISH)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等免培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)(cultivation-independenttechnique)逐漸成為研究活性污泥菌群的主要手段,活性污泥中菌群的復(fù)雜性和多樣性也以驚人的速度被人們認(rèn)識(shí),大量傳統(tǒng)檢測方法未能發(fā)現(xiàn)卻在活性污泥中起關(guān)鍵作用的微生物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),如:具有除磷作用的類紅環(huán)菌(Rhodocyclus)、小月菌(Microlunatusspp.)、類Tetrasphaera的棒狀菌、俊片菌(Lampropediaspp.)等;具有脫氮作用的反硝化生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、固氮弧菌屬(Azoarcu)相關(guān)菌、類硝化螺菌(Nitrospira)等;與污泥泡沫有關(guān)的諾卡氏菌形放線菌(Nocardioformactinomycetes)、絲狀菌(Microthrixparvicella)和Nostocoidalimicola等。免培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)和完善,使環(huán)境微生物學(xué)家能夠直接使用污泥材料研究和了解活性污泥菌群的結(jié)構(gòu)和豐度,活性污泥中許多建立在16SrRNA基礎(chǔ)上的新的微生物類群被人類認(rèn)識(shí),這大大加深了人們對(duì)活性污泥菌群結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。為了深入了解免培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)的大量新的菌群的生理特性和作用機(jī)制,20世紀(jì)90年代后期許多模擬活性污泥菌群生存環(huán)境的現(xiàn)代培養(yǎng)技術(shù)開始發(fā)展,且已成功培養(yǎng)了一部分傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)不能培養(yǎng)的新培養(yǎng)物,這無疑將把人們對(duì)活性污泥菌群的研究推向一個(gè)新的層次。1平板分離法熱法傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法是將定量樣品接種于高濃度營養(yǎng)物的選擇性培養(yǎng)基中,對(duì)生長的菌落計(jì)數(shù),并通過觀察各種微生物的生理生化特性及形態(tài)構(gòu)造等進(jìn)行種屬分類鑒定。作為微生物研究的經(jīng)典手段之一,分離培養(yǎng)方法在研究活性污泥菌群過程中起到十分重要的作用。1964年Dias等采用平板分離法從活性污泥的7個(gè)樣品中分離了300多個(gè)菌株,其中最占優(yōu)勢的是動(dòng)膠桿菌屬和叢毛單胞菌屬。Benedict等于1971年從實(shí)驗(yàn)室和城市污水處理廠的兩種活性污泥樣品中培養(yǎng)、挑取129個(gè)菌落,經(jīng)鑒定主要有不動(dòng)桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、短桿菌屬、叢毛單胞菌屬、黃桿菌屬、假單胞菌屬等。此法要求比較簡單,很適合用來分離一些具有一定功能的微生物,還常用于一些科研工作者的初步研究。但是此法有很大的局限性:①培養(yǎng)基對(duì)某些菌群的選擇性;②某些細(xì)菌和其它細(xì)菌之間有共生現(xiàn)象,不能單獨(dú)生長(此類細(xì)菌占至今未能培養(yǎng)微生物的很大一部分);③很多細(xì)菌具有難以分辨的相似形態(tài)、生理生化特性。所以,此方法不能真實(shí)的反映活性污泥菌群結(jié)構(gòu),尤其是對(duì)那些具有重要功能仍未能培養(yǎng)的菌群的檢測。2細(xì)胞細(xì)菌分離生物標(biāo)記物法(biomarker)是在分類學(xué)上通過細(xì)胞特有的脂肪酸、呼吸醌等“環(huán)境樣品信號(hào)”來表征、區(qū)分和鑒定細(xì)菌屬、種和株等的方法。此方法可以避免形態(tài)觀察方法帶來的人為誤差,從而進(jìn)行定性定量分析。2.1脂肪酸圖譜法常用的脂肪酸圖譜法可分為兩種:磷脂脂肪酸(PLFAs)圖譜法和全細(xì)胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)圖譜法。前者的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確、可靠;而后者的優(yōu)點(diǎn)是提取簡捷,所需樣品量少。脂肪酸異丙酯(FAPEs)圖譜法是最近發(fā)展的一種脂肪酸圖譜法,采用強(qiáng)度更低的試劑(酸性異丙醇)和更簡便的處理方法將提取的脂肪酸異丙基化,分析的對(duì)象是脂肪酸異丙酯。脂肪酸通常具有屬的特異性,不同微生物具有不同的脂肪酸種類和數(shù)量,因此,可以通過脂肪酸譜圖分析來快速有效監(jiān)測群落的微生物結(jié)構(gòu)變化。Werker等同時(shí)采用MIDI-FAME圖譜法和FAPEs圖譜法分析了城市污水處理廠活性污泥中的菌群結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者相似但存在一定的差別,可期待用校正因子的方法來比較兩種方法的差別,研究還說明,脂肪酸異丙酯(FAPEs)具有簡便、靈敏、可重復(fù)的特點(diǎn),對(duì)環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的分析有很大的應(yīng)用前景。Conrad等對(duì)2個(gè)污水處理廠的活性污泥絮凝體進(jìn)行脂肪酸圖譜比較分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌群結(jié)構(gòu)有所差異,但脂肪酸圖譜相似。脂肪酸圖譜法雖然能夠快捷有效的從環(huán)境樣品中提取脂肪酸進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)的分析,但也有一定的局限性:①對(duì)微生物的分類水平較低,不能鑒定到種;②對(duì)標(biāo)記脂肪酸有強(qiáng)烈的依賴性;③復(fù)雜的環(huán)境微生物樣品中不同微生物種屬之間脂肪酸組成的重疊和外來生物污染容易導(dǎo)致一定的偏差。2.2生物圖譜和圖譜醌類圖譜(QuinoneProfile)法是以特征化合物醌為標(biāo)記來解析微生物群體組成的方法。有兩類主要的呼吸醌:泛醌(ubiquinone,UQ)即輔酶Q和甲基萘醌(menaquinone,MK)即維生素K。不同的微生物含有不同種類和分子結(jié)構(gòu)的醌,因此,醌的多樣性可定量表征微生物的多樣性,醌圖譜的變化可表征群落結(jié)構(gòu)的變化。Hiraishi等比較了增強(qiáng)型生物除磷(EBPR)類型或一般類型、自然污水或人工污水、處理廠規(guī)?；?qū)嶒?yàn)室規(guī)模不同情況下的活性污泥菌群結(jié)構(gòu)的生物醌圖譜,發(fā)現(xiàn)泛醌(Q)和甲基萘醌(MK)的摩爾比(MK/Q)總體上為0.455～0.981,數(shù)據(jù)顯示EBPR和一般活性污泥中的主要組成菌都是屬于β-變形桿菌的含Q-8菌種,其次是屬于高G+C的革蘭氏陽性菌(HGC)的放線菌門。雖然此方法是一種可靠的分析方法,然而也存在一定的局限性,它不能反映具體某個(gè)屬或種的變化。3活性污泥中的-、-桿菌和hcg20多年前,以16SrRNA為主要基礎(chǔ)的PCR技術(shù)、電泳技術(shù)、克隆文庫技術(shù)、熒光原位雜交和流式細(xì)胞術(shù)等免培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)開始應(yīng)用到活性污泥菌群的研究,真實(shí)反映了環(huán)境樣品中菌群的結(jié)構(gòu)和豐度,避免了傳統(tǒng)方法在菌群檢測中低豐度易培養(yǎng)細(xì)菌被高估的局限性,促進(jìn)了活性污泥菌群高度多樣性的研究。Fuhs和Chen利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法研究認(rèn)為,屬于γ-變形桿菌(Proteobacteria)亞綱的不動(dòng)桿菌是活性污泥中除磷的優(yōu)勢菌(占總培養(yǎng)菌落的30%～60%)。但是,Wagner等利用分子生物學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn),不動(dòng)桿菌數(shù)量很少(僅占總細(xì)菌的1%～10%),并沒有聚磷作用,只是由于其易培養(yǎng)性被高估了,同時(shí),發(fā)現(xiàn)在活性污泥中大量存在的是β-、α-變形桿菌和HGC。大量研究表明,β-變形桿菌是活性污泥中豐度最大的類群,其次有(α-、γ-變形桿菌、HGC、黃桿菌(Cytophaga-FlavobacteriumofBacteroidetes,CF)和放線菌(Actinobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)、硝化螺旋菌(Nitrospira)和浮霉菌(Planctomycetes)等[6,21,22,23,24,25,26]。3.1pcr及其相關(guān)技術(shù)3.1.1t-rflp擴(kuò)增末端限制性片段多態(tài)性(Terminal-Restrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP)法是由RFLP發(fā)展而來的方法,又稱為16SrRNA基因的末端限制性片段,是將PCR引物中的一條加以熒光標(biāo)記,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割并電泳,根據(jù)片斷的大小不同以及標(biāo)記片斷種類和數(shù)量的不同來分析群落的結(jié)構(gòu)及組成。現(xiàn)在很多研究人員利用T-RFLP來研究活性污泥的微生物菌群結(jié)構(gòu),還用來監(jiān)測因環(huán)境改變而引起的菌群變化。Tsuneda等以亞硝酸鹽還原酶基因(Nitritereductasegene,nirS)為基礎(chǔ)對(duì)一個(gè)序批反應(yīng)器(SBR)的反硝化聚磷菌(Denitrifyingpolyphosphate-accumulatingorganisms,DNPAOs)進(jìn)行RFLP分析,發(fā)現(xiàn)一個(gè)占70%所有克隆的nirS克隆,其序列相似于紅環(huán)菌類群的兩類細(xì)菌:陶厄氏菌屬(Thaueramechernichensis)(83%相似性)和固氮弧菌屬(Azoarcustolulyticus)(83%相似性)。3.1.2材料的選擇性和穩(wěn)定性ERIC-PCR實(shí)際上是一種長引物RAPD技術(shù)。ERIC序列(EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensusSequence)是首先在腸道細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)的長為126bp的非編碼保守重復(fù)序列,該序列在細(xì)菌染色體上分布的多態(tài)性允許設(shè)計(jì)特異引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增而形成具有種、屬、菌株特異性的指紋圖譜,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于純培養(yǎng)細(xì)菌的鑒別、分類、基因組多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化等方面的研究。陳敏等人用ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)檢測了活性污泥菌群結(jié)構(gòu)及其變化,結(jié)果表明,在缺氧池和好氧池之間,各個(gè)采樣點(diǎn)的ERIC-PCR圖譜差異不大,懸浮污泥在各構(gòu)筑物之間交流充分;同一采樣點(diǎn)的圖譜在不同采樣時(shí)期具有明顯差異。ERIC-PCR的局限性:①不能提供關(guān)于種群組成的信息;②重現(xiàn)性差;③由于長度相同的DNA片斷其序列可能不一樣,可能會(huì)高估樣品間的相似性。ERIC-PCR與其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合使用可能更加準(zhǔn)確地反映微生物群落結(jié)構(gòu)。3.1.3aod活性污泥pcr-dage變性/溫度梯度凝膠電泳(Denaturing/Temperaturegradientgelelectrophoresis,DGGE/TGGE)是依據(jù)雙鏈DNA片斷熔解行為的不同,分離PCR產(chǎn)物中長度相同但序列不同的DNA標(biāo)記片斷(rRNA或rDNA)。從理論上講,DGGE/TGGE指紋圖上的一個(gè)條帶就代表一個(gè)微生物類群(分類水平可達(dá)種)。因而,指紋圖譜不但直觀反映了微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性,還可方便判斷出優(yōu)勢菌或功能菌。此方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于活性污泥菌群的研究。Onuki等對(duì)一個(gè)添加乙酸鹽SBR反應(yīng)器的活性污泥中除磷的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行PCR-DGGE分析,發(fā)現(xiàn)紅環(huán)菌屬(屬于β-變形桿菌)相關(guān)菌是積磷菌,并利用這種PAOs的特異探針進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)和DAPI染色,研究進(jìn)一步說明紅環(huán)菌屬-相關(guān)菌確實(shí)有聚磷作用。Limpiyakorn等以16SrDNA為基礎(chǔ)對(duì)東京8個(gè)污水處理廠的12個(gè)活性污泥樣品中氨氧化細(xì)菌(AOB)的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行DGGE分析,結(jié)果顯示,每個(gè)處理廠低氨濃度的污水中Nitrosomonasoligotropha類似細(xì)菌占優(yōu)勢,僅在一個(gè)相對(duì)高氯化氨濃度的A2O系統(tǒng)中恢復(fù)到Nitrosomonaseuropaea-和Nitrosomonascryotolerans-類似序列,在每一個(gè)A20和AO系統(tǒng)都發(fā)現(xiàn)Nitrosomonascommunis-類似序列,但在一個(gè)AS系統(tǒng)幾乎沒有發(fā)現(xiàn),總之,污水特性和運(yùn)行參數(shù)都會(huì)影響AOB群落結(jié)構(gòu)。該法回收的DNA片斷,通過測序后與基因序列數(shù)據(jù)庫中的已知序列比較,可以確定其種系發(fā)育位置,還可設(shè)計(jì)成探針,用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)監(jiān)測微生物菌群的變化。但是DGGE對(duì)有多個(gè)不同堿基序列差異的DNA片段的分離有一定局限性,可能低估了環(huán)境微生物的種群多樣性。3.1.4非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳單鏈構(gòu)象多態(tài)性研究(SingleStrandConformationPolymorphism,SSCP)方法,是指呈復(fù)雜空間折疊構(gòu)象的單鏈DNA或RNA片段,當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí),空間構(gòu)象便發(fā)生改變,空間構(gòu)象有差異的單鏈分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此,通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。Sabine等用該法研究活性污泥菌群結(jié)構(gòu)和演替,并同傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法比較指出SSCP方法避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力以及誤差大的干擾,適合對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和演替的分析。Dabert等利用SSCP法研究bioaugmentation對(duì)EBPR實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器的活性污泥除磷作用的影響,發(fā)現(xiàn)PAOs和GAOs的競爭是EBPR啟動(dòng)成敗的關(guān)鍵。3.1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR,RT-PCR)技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。2005年Limpiyakorn等用該法對(duì)活性污泥的氨氧化細(xì)菌進(jìn)行定量檢測,并結(jié)合使用PCR-DGGE、16SrRNA測序分析研究了氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,氨氧化菌總數(shù)會(huì)隨季節(jié)變化,而菌群結(jié)構(gòu)沒有變化,檢測到的主要菌群與2004年進(jìn)行DGGE檢測的結(jié)果基本一致。由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前已得到廣泛應(yīng)用。3.1.6srrna擴(kuò)增研究盡管PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE等電泳技術(shù)后的凝膠條帶可以通過回收測序進(jìn)行菌群分類初步分析,然而通過建立細(xì)菌16SrRNA文庫的方法可以進(jìn)行更為深入的分析。rRNA序列比較是通過比較分析緩慢進(jìn)化的rRNA分子成分,從而在微生物系統(tǒng)發(fā)育上進(jìn)行分類。其主要步驟包括:①樣品中總DNA的提取;②建立基于λ噬菌體的DNA克隆文庫;③以種類特異性的16SrRNA探針篩選文庫;④測序;⑤序列的比較分析。Kong等通過利用該法在活性污泥中發(fā)現(xiàn)γ-變形桿菌的一個(gè)多形球桿菌(coccobacilli)新分支,并進(jìn)行FISH研究發(fā)現(xiàn)此新類群廣泛分布,在9個(gè)EBPR類型(占總細(xì)胞數(shù)的10%～50%)和4個(gè)一般類型(1%～10%)中顯著出現(xiàn)。Chouari等對(duì)活性污泥中浮霉菌門的多樣性進(jìn)行16SrRNA序列分析,發(fā)現(xiàn)了4個(gè)已知菌屬Pirellula(32%)、Planctomyces(18.4%)、Gemmata(3.8%)和Isosphaera(0.4%),并設(shè)計(jì)新特異探針進(jìn)行FISH檢測發(fā)現(xiàn)活性污泥中存在很多此類群的細(xì)菌。Liu等通過對(duì)除磷活性污泥中的114個(gè)克隆進(jìn)行16SrRNA序列分析,并結(jié)合FISH研究發(fā)現(xiàn),污泥中的多樣性類群有:變形桿菌(71.0%)和黃桿菌(23.7%),還有新類群Planctomycetales(2.6%)、Verrucomicrobiales(1.8%)和Firmicutes(0.9%)。3.2核酸熒光原位雜交熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescentinsituhybridization,FISH)是由Gall和Pardue最早描述,其間經(jīng)歷了放射性標(biāo)記探針階段和熒光標(biāo)記探針階段。與放射性探針相比,熒光探針具有以下優(yōu)點(diǎn):安全、簡便、靈敏、快速,可同時(shí)檢測幾種微生物。核酸熒光原位雜交是指通過熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針特異地和互補(bǔ)核酸序列在完整的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合,用顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)等熒光檢測技術(shù)進(jìn)行觀察和分析。核酸探針是通過比較16SrRNA序列和數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行設(shè)計(jì),可在不同水平(類群、屬、種等)上進(jìn)行目標(biāo)細(xì)菌的原位檢測。具體過程包括以下幾步:①固定標(biāo)本;②預(yù)處理樣品;③用相應(yīng)的探針進(jìn)行雜交;④洗掉未結(jié)合的探針;⑤信號(hào)的儀器(普通熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡或流式細(xì)胞儀)檢測及結(jié)果分析。影響FISH的主要因素有:①目標(biāo)細(xì)胞的rRNA數(shù)量;②寡核苷酸的滲透能力;③自發(fā)熒光的干擾。FISH具有快速、準(zhǔn)確、原位等諸多優(yōu)點(diǎn),避免了由于核酸抽提和PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的一定程度偏差,因此,以rRNA為基礎(chǔ)的熒光原位雜交可以得到特定微生物在環(huán)境中的存在、空間分布和豐度以及整個(gè)微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)及其多樣性等全面信息。3.2.1常用的熱價(jià)值高值顯微方法顯微術(shù)所利用的顯微鏡有:落射熒光顯微鏡(EpifluorescenceMicroscopy,EM),激光掃描共聚焦顯微鏡(LaserScanningConfocalMicroscopy,LSCM),雙光子激發(fā)激光掃描顯微鏡(Two-PhotonExcitationLaserScanningMicroscopy,TPE-LSM)。2005年Lopez等以活性污泥為對(duì)象比較了3種顯微鏡各自的優(yōu)缺點(diǎn),研究表明細(xì)胞密度較大的菌膠團(tuán)適合用TPE-LSM法,但典型的活性污泥菌膠團(tuán)適合用EM和CLSM法。這些方法雖然直觀,但是人工計(jì)數(shù)來定量活性污泥中的菌群結(jié)構(gòu)時(shí)會(huì)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來主觀性偏差。TPE-LSM由于其價(jià)格昂貴,使用較少。(1)熒光探針檢測EM是常用的普通熒光檢測儀器,因?yàn)樗鼧?gòu)造簡單,使用方便,一直被廣泛使用。Manser等以硝化菌形成的菌團(tuán)數(shù)目和大小為基礎(chǔ),發(fā)展了一個(gè)用EM快速定量檢測活性污泥硝化細(xì)菌的方法,結(jié)果顯示,氨氧化細(xì)菌和亞硝酸氧化菌分別進(jìn)行10～15和6～8個(gè)觀察視野為精確檢測的最佳選擇。1993年Wagner等利用EUB338、ALF1b、BET42a和GAM42a等熒光探針特異性地和活性污泥原位雜交,定量檢測了各類群的豐度,結(jié)果顯示3個(gè)變形桿菌亞綱類群的總含量超過了活性污泥總細(xì)胞數(shù)的80%。Elkelboom等用FISH方法對(duì)活性污泥中絲狀微生物研究,檢測到59種絲狀菌種,包括新發(fā)現(xiàn)的ca.40菌種。Wong等對(duì)日本的9個(gè)不同污水處理廠的13個(gè)活性污泥樣品菌群進(jìn)行FISH研究,結(jié)果顯示,紅環(huán)菌屬-相關(guān)的聚磷菌(PAOs)和聚糖菌(GAOs)是優(yōu)勢菌;然而,DAPI聚磷染色發(fā)現(xiàn),一部分紅環(huán)菌屬-相關(guān)PAOs卻沒有聚磷作用。這進(jìn)一步說明:紅環(huán)菌屬-相關(guān)PAOs和污泥磷含量有很低的相關(guān)性,這些非紅環(huán)菌屬-相關(guān)的PAOs還包括其它類群的細(xì)菌。(2)fish技術(shù)LSCM能除去焦外熒光,圖像強(qiáng)度高,可以進(jìn)行多層次的空間觀察,適用于較濃稠或有較高背景值的樣品,有很大的應(yīng)用前景。Coskuner等用FISH技術(shù)在種屬水平原位鑒定了活性污泥中硝化細(xì)菌群落的組成和分布,發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌是亞硝化螺菌屬(Nitrosospira),而不是以前認(rèn)為的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)。Schmid等通過LSCM的三維觀察研究發(fā)現(xiàn),活性污泥菌群結(jié)構(gòu)隨著活性污泥絮凝體的沉降性能而變化。3.2.2細(xì)菌的分散過程流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry,FCM)是一種對(duì)處在液體中的細(xì)胞或其他生物微粒逐個(gè)進(jìn)行多參數(shù)快速(每秒103個(gè)細(xì)胞以上)定量分析和分選的技術(shù),具有自動(dòng)而快速、客觀、直接和同時(shí)檢測多參數(shù)的優(yōu)點(diǎn),可以很好的避免顯微術(shù)人工計(jì)數(shù)的主觀性偏差。但是流式細(xì)胞術(shù)也有其設(shè)備昂貴、需專業(yè)操作人員、標(biāo)本需前處理等局限性。FCM快速檢測和鑒定活性污泥菌群的主要影響因素是樣品的細(xì)胞分散過程,因?yàn)榛钚晕勰嘀屑?xì)菌多是以絮凝體即菌膠團(tuán)的形式存在,未能很好分散細(xì)菌會(huì)對(duì)分析結(jié)果造成很大的偏差。分散細(xì)菌的方法有:研磨法、小玻璃珠法、超聲波法和均勻化法等。最近,Falcioni等利用核酸染色后FCM的分析來比較超聲波法和均勻化法對(duì)細(xì)菌的分散效果,結(jié)果顯示,超聲波法對(duì)細(xì)胞存活結(jié)果和分析速度的效果較好。但是,對(duì)于不同的樣品和不同的實(shí)驗(yàn)要求還需要根據(jù)細(xì)胞存活結(jié)果和分析速度來選擇合適的預(yù)處理方法。許多研究者成功地結(jié)合使用FCM和FISH對(duì)簡單的人工培養(yǎng)的微生物細(xì)胞群或諸如活性污泥等復(fù)雜的微生物自然群落進(jìn)行了分析。Wallner等采用FCM對(duì)一個(gè)城市污水處理廠的活性污泥的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示此活性污泥中變形桿菌綱的β-、γ-、和α-亞綱分別占41%、7.7%和1.7%,不動(dòng)桿菌屬占4.7%。Zilles等利用FISH和FCM結(jié)合研究了2個(gè)EBPR活性污泥中除磷微生物,盡管在添加乙酸的反應(yīng)器中研究發(fā)現(xiàn)了一種仍未能培養(yǎng)的candidatusaccumulibacterphosphatis具有強(qiáng)化去磷作用,但不是主要PAO,此研究結(jié)果表明厭氧/好氧工藝的運(yùn)行的作用菌可能是多種PAO的菌群。3.3dna微陣芯片檢測微陣列(microarray)或生物芯片技術(shù)的引入增強(qiáng)了核酸雜交技術(shù)解析微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的能力。DNA微陣技術(shù)含多種不同DNA探針,可以對(duì)于那些還沒有可行探針信息的情況進(jìn)行隨機(jī)基因組雜交,從而檢測出環(huán)境樣品的復(fù)雜菌群中的特異菌種,還可測定結(jié)構(gòu)和多樣性已知的群落的變化,更因其高度并行性、微型性、自動(dòng)化和快速檢測的特點(diǎn),顯示出廣闊的應(yīng)用前景。Kim等以不同屬的13個(gè)菌株作為目標(biāo),建立DNA微陣芯片對(duì)純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,不需要純培養(yǎng)菌株的任何種系發(fā)育水平的序列信息即可通過DNA微陣芯片來檢測特定菌種,對(duì)活性污泥樣品中的特定菌種檢測也是一種快速特異的方法。Loy等為了檢測β-變形桿菌的紅環(huán)菌的數(shù)量,發(fā)展了16SrRNA目標(biāo)的79個(gè)寡核苷酸探針的微陣列(RHC-PhyloChip),直接用于活性污泥中紅環(huán)菌目的多樣性分析,試驗(yàn)表明可以檢測相對(duì)豐度不到總菌數(shù)1%的紅環(huán)菌,另外,對(duì)未能培養(yǎng)的動(dòng)膠桿菌-,Ferribacterium/脫氯單胞菌(Dechloromonas)-和Sterolibacterium-相關(guān)菌的分析證明RHC-PhyloChip確實(shí)是一個(gè)研究環(huán)境微生物菌群的新型有力工具。4vbnp菌群的分離培養(yǎng)雖然免培養(yǎng)分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了活性污泥中存在著大量的活的但未能培養(yǎng)(Viablebutnonculturable,VBNC)菌群,且在一定程度上能夠讓人們?cè)谠粚?duì)活性污泥菌群的分布和功能進(jìn)行研究,但要深入了解這些菌群的生理特性和它們對(duì)污染物的降解機(jī)制,還需要得到純培養(yǎng)物。然而傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的內(nèi)在選擇性大大限制了其獲得純培養(yǎng)物的能力。因此,迫切需要發(fā)展新的培養(yǎng)方法來得到VBNC菌群的純培養(yǎng)物。近年來已有不少科技工作者致力于新分離培養(yǎng)技術(shù)的研究,研究顯示,在培養(yǎng)過程中構(gòu)建類似于污泥運(yùn)行環(huán)境的生長條件,有可能得到某些VBNC菌群的純培養(yǎng)物?，F(xiàn)代培養(yǎng)技術(shù)主要手段有:①單細(xì)胞操作技術(shù)(如光鑷技術(shù)和激光顯微解剖法);②模擬自然環(huán)境(如:降低營養(yǎng)物質(zhì)的濃度;添加非傳統(tǒng)的營養(yǎng)物,信號(hào)分子或抑制因子;延長培養(yǎng)時(shí)間;直接接種到自然環(huán)境);③微膠囊裹細(xì)胞法。2002年Zengler等發(fā)展一種微膠囊裹細(xì)胞法,大量包裹的細(xì)胞在低營養(yǎng)物下同時(shí)培養(yǎng),然后用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測含有微克隆的微滴,此方法已成功用于海水和土壤等環(huán)境樣品中VBNC微生物的培養(yǎng)研究,同時(shí),2005年他們又進(jìn)一步把FCM分選到的目的微滴接到豐富培養(yǎng)基上進(jìn)行大量培養(yǎng),從而得到更多仍未培養(yǎng)或環(huán)境中豐度較低的微生物。現(xiàn)代培養(yǎng)技術(shù)在活性污泥中新發(fā)現(xiàn)菌群的培養(yǎng)和生理功能的研究中已經(jīng)有應(yīng)用,目前已經(jīng)成功培養(yǎng)了很多傳統(tǒng)方法未能培養(yǎng)的培養(yǎng)物,如Mas