熒光原位雜交技術(shù)在微生物群落研究中的應(yīng)用

熒光原位雜交技術(shù)在微生物群落研究中的應(yīng)用

在許多微生物生態(tài)學(xué)、微生物診斷和環(huán)境微生物的領(lǐng)域，需要一種快速、特異性的檢測(cè)方法。但是常規(guī)的培養(yǎng)基培養(yǎng)方法通常費(fèi)時(shí)費(fèi)力,尤其對(duì)于選擇性高、營(yíng)養(yǎng)需求復(fù)雜或目前為止無(wú)法培養(yǎng)的微生物種類,無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速的培養(yǎng)和有效的檢測(cè)?；诖?近年來(lái)國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者先后開(kāi)展了分子生物學(xué)方法的建立及生物學(xué)評(píng)價(jià)工作,從而更快、更精確地揭示微生物的種類和多樣性。目前常用的分子生物學(xué)方法包括基于PCR的核酸技術(shù)(PCR-RFLP,PCR-SSCP,PCR-DGGE,RT-PCR等),DNA直接測(cè)序等。然而這些方法無(wú)法提供微生物形態(tài)學(xué)、空間分布和生物體的細(xì)胞環(huán)境等信息,并且PCR對(duì)環(huán)境樣品分析存在一定的偏差。熒光原位雜交(FluorescenceInSituHybridization,FISH)技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)的精確性和顯微鏡的可視性,可進(jìn)行微生物的空間分布情況分析和特征性微生物的鑒定與定量分析。1989年,DeLong首次將熒光標(biāo)記寡核苷酸探針應(yīng)用于檢測(cè)單個(gè)微生物細(xì)胞,開(kāi)創(chuàng)了應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)的先河。由于該法操作容易、安全、檢測(cè)迅速,目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)和食品學(xué)等領(lǐng)域,成為研究微生物群落最具生命力的技術(shù)之一。1熒光原位雜交熒光原位雜交技術(shù)由原位雜交技術(shù)(InsituHybridization,ISH)發(fā)展而來(lái),其間經(jīng)歷了放射性標(biāo)記探針和熒光標(biāo)記探針2個(gè)階段。最近10a,熒光原位雜交技術(shù)已成為鑒定環(huán)境微生物的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法。熒光原位雜交技術(shù)的原理是dsDNA變性后和帶有互補(bǔ)序列的同源單鏈退火配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)的過(guò)程。退火復(fù)性形成的可以是雙鏈DNA或DNA/RNA異質(zhì)雙鏈分子,帶有熒光標(biāo)記的探針與固定在玻片或纖維膜上的組織或細(xì)胞中特定的核苷酸序列進(jìn)行雜交,探測(cè)其中所有的同源核酸序列,結(jié)果可直接在共聚焦激光掃描顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察,無(wú)需單獨(dú)分離DNA或RNA。此技術(shù)包括如下步驟:樣品固定、樣品的制備與預(yù)處理、預(yù)雜交、探針和樣品的變性、雜交、漂洗和檢測(cè)信號(hào)等。下面簡(jiǎn)要介紹FISH技術(shù)中的4個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié):探針與標(biāo)記、熒光染料、FISH的靶序列、雜交。1.1熒光標(biāo)記法FISH所采用的探針必須具有特異性強(qiáng),靈敏度高,良好的組織滲透性。一個(gè)典型的寡核苷酸探針長(zhǎng)度一般是15~30bp。標(biāo)記的方法一般有以下幾種:①直接熒光標(biāo)記,通過(guò)熒光素與探針核苷或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合,或是摻入熒光素-核苷三磷酸,一個(gè)或更多熒光素分子直接結(jié)合到寡核苷酸上,在雜交以后直接檢測(cè)熒光信號(hào)。它是使用最普遍,最簡(jiǎn)單,最快,最便宜的標(biāo)記方法;②間接熒光標(biāo)記,是指將標(biāo)記物(如地高辛、生物素)連接到探針上,然后利用偶聯(lián)有熒光染料的親和素或抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。熒光素-異硫氰酸(FITC)通過(guò)18-C間隔物偶聯(lián)到寡核苷酸與直接連接到探針上相比可以增加熒光信號(hào)。1.2背景染料的檢測(cè)由于不同的熒光染料通常具有不同的激發(fā)和散射波長(zhǎng),因此可以同時(shí)觀察兩種或更多的微生物。為了清晰地同時(shí)觀察兩種以上的微生物,就需要多波峰的濾鏡及要求熒光染料具備狹窄的散射峰,以免探針之間光譜的重疊。常用的熒光染料有熒光素衍生物(FITC、FluoX)、羅丹明衍生物(TRITC、TexasRed)和吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)等,而吲哚二羧菁與前者相比具有亮度高和光熄滅穩(wěn)定性。背景染料可以用DAPI,來(lái)界定生物體的細(xì)胞區(qū)域。Davenport等用TRITC標(biāo)記mycolata菌種探針和用FITC標(biāo)記細(xì)菌通用探針,從而來(lái)定量每毫升樣品中mycolata細(xì)胞數(shù)量。Liao等用Cy3標(biāo)記的S-S-S.nat-0656-a-A-18探針進(jìn)行雜交,在顯微鏡下,S.natans細(xì)胞顯紅色,把DAPI作為背景染料,使所有的細(xì)胞顯藍(lán)色,從而對(duì)接種于完全混合反應(yīng)器中一天后的S.natans細(xì)胞進(jìn)行定量。1.3種屬鑒定和定量鑒定在微生物學(xué)的研究中通常使用的靶序列是16SrRNA,這是由于細(xì)胞體內(nèi)核糖體RNA(rRNA)量的豐富性,且具有特異區(qū)和高度保守區(qū)。因此可以根據(jù)rRNA目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)探針,進(jìn)行種屬的特征性鑒定。近年來(lái),還出現(xiàn)了應(yīng)用核酸肽(PNA)探針的FISH技術(shù)對(duì)特征性微生物進(jìn)行鑒定和定量的研究。Lehtola等應(yīng)用PNA-FISH技術(shù)直接檢測(cè)和鑒定生活用水過(guò)濾膜上的M.Avium和subsp.Avium。1.4fish的制備在保持細(xì)胞形態(tài)的條件下,進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的雜交與顯色來(lái)分析DNA或RNA。包括以下步驟:①細(xì)胞的固定與處理:有效的細(xì)胞固定對(duì)于獲得滿意的FISH結(jié)果是至關(guān)重要的,而預(yù)處理就是要增加細(xì)胞組織的滲透性以及減少非特異性目標(biāo)序列的結(jié)合。一般采用4%多聚甲醛固定,用蛋白酶K或HCl預(yù)處理;②雜交:這是FISH技術(shù)操作過(guò)程的核心部分。雜交一般在37℃到50℃,雜交時(shí)間為30min到幾個(gè)小時(shí);③樣品的洗滌:用48℃水浴的清洗液及冰浴的超純水清洗;④封片觀察:即用共聚焦激光掃描顯微鏡或熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。2fish技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用FISH技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種環(huán)境的微生物群落分析,分析的主要對(duì)象有人工創(chuàng)制微生物群落和自然微生物群落2大類。2.1采用fish技術(shù)的熱反應(yīng)FISH技術(shù)為人工創(chuàng)建生物處理系統(tǒng)的最佳工況條件提供了理論依據(jù),并為提高相應(yīng)的處理能力和處理水平提供了新的思路。Ercolini等用干酪中優(yōu)勢(shì)微生物的特異探針進(jìn)行FISH雜交來(lái)研究完好干酪中的微生物群落,通過(guò)顯微鏡觀察到其均勻分布于干酪中,且干酪懸浮液中存在不同形態(tài)微生物群落。據(jù)此可以通過(guò)觀察微生物群落的分布情況來(lái)判斷干酪的質(zhì)量。Calli等在研究厭氧反應(yīng)器里產(chǎn)甲烷菌的多樣性時(shí),用FISH技術(shù)成功的監(jiān)控到隨著氨濃度的提高,產(chǎn)甲烷菌呈現(xiàn)出更好的多樣性,同時(shí)發(fā)現(xiàn)在極高的氨濃度下,Methanosarcina菌種非常豐富。Icgen等在連續(xù)厭氧反應(yīng)器內(nèi)處理含硫酸鹽廢水,用FISH技術(shù)研究了在不同硫酸鹽負(fù)荷下,硫還原菌群落結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換。研究表明,在沒(méi)有受到硫酸鹽負(fù)荷沖擊前,Desulfonema、Desulfobulbus和Desulfobacteriaceae是主要的硫還原細(xì)菌(SRB)菌種;當(dāng)硫酸鹽達(dá)到極高濃度時(shí),Desulfobacter、Desulfotomaculum和Desulfovibrionaceae成為優(yōu)勢(shì)菌種。Ramsing等用熒光寡核苷酸探針檢測(cè)了在光合生物膜上的硫還原細(xì)菌,分析表明SRB不是平均分布在生物膜上,而在缺氧層被嚴(yán)格限制。Eschenhagen等用FISH技術(shù)監(jiān)控兩個(gè)不同活性污泥系統(tǒng)微生物結(jié)構(gòu)的變化以及根據(jù)特異探針推測(cè)聚磷菌的組成和分布,在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Tetrasphaeraspp.是主要的聚磷菌,但同時(shí)也觀察到像Microlunatusspp和Rhodocyclusgroup其他的聚磷菌。Silyn-Roberts等應(yīng)用FISH技術(shù)對(duì)廢水處理濕地生物膜進(jìn)行了研究,結(jié)果表明亞硝化單胞菌屬是主要的氨氧化細(xì)菌。Neef等針對(duì)兩種嗜溫放線菌Saccharomonospora和Thermoactinomyces,用FISH技術(shù)快速鑒定和直接觀察了在堆肥揮發(fā)物中的這兩種菌,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)堆肥過(guò)程的有效監(jiān)控。Hiraishi等用FISH技術(shù)研究用花盆廢物作為序批式反應(yīng)器啟動(dòng)原料進(jìn)行家庭生物垃圾堆肥中微生物群落的變化,發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)階段組成微生物群落的主要菌類從Proteobacteria變化到Actinobacteria。2.2nobacteria的菌屬FISH技術(shù)為復(fù)雜自然環(huán)境樣品提供一種鑒定和定量微生物以及了解微生物群落動(dòng)態(tài)變化的方法。Warnecke等用FISH技術(shù)對(duì)沿同一海拔梯度的10條山地河流(水面受到紫外線照射)中的微生物組成進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)Actinobacteria和β-proteobacteria是主要菌種;并鑒定了Actinobacteria的菌屬,分析表明來(lái)自acI分化枝不同世系的Actinobacteria組成了河流的微生物群落。Girguis等將從深海沉積物中厭氧富集培養(yǎng)的古菌,用FISH技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。依靠傳統(tǒng)方法對(duì)水體中亞歷山大藻進(jìn)行監(jiān)測(cè)很難奏效,然而Sako等用FISH技術(shù)快速且成功的檢測(cè)到了亞歷山大藻(有害藻類),可以及時(shí)地防止赤潮問(wèn)題。Kobabe等用FISH技術(shù)分析了永久凍結(jié)層上溶化層微生物的組成,研究發(fā)現(xiàn)在不同的地平線上,細(xì)胞量和活性微生物的組成是完全不同的,從表層到底部的每千克干土壤中細(xì)胞數(shù)從2.3×109個(gè)減少到1.2×108個(gè),這是由于垂直分布生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境條件不同所引起的。Watt等用FISH技術(shù)分析了生長(zhǎng)小麥根系的土著細(xì)菌、假單胞菌、絲狀菌的量以及分布情況?？臻g分析表明細(xì)菌在根部表面(2~30μm范圍)11μm之內(nèi)處于穩(wěn)定的狀態(tài),40%在根部叢生。定量分析表明在小麥根系細(xì)菌平均細(xì)胞量為15.4×105cells/mm3,假單胞菌、絲狀菌的量分別占總菌數(shù)的10%和4%。3fish的缺點(diǎn)和解決方案3.1探針的特異性分析:點(diǎn)交互作用、個(gè)案研究和背景熒光在FISH檢測(cè)中,寡核苷酸探針的特異性決定了檢測(cè)結(jié)果的可靠性和精確性,所以通常希望設(shè)計(jì)得到的寡核苷酸最好與數(shù)據(jù)庫(kù)中的寡核苷酸一樣的精確。現(xiàn)存數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷擴(kuò)大和所報(bào)道序列的非精確性,探針序列的檢測(cè)最好用最常規(guī)、最新版本的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行校對(duì)。而對(duì)于一些培養(yǎng)條件苛刻的和暫時(shí)無(wú)法培養(yǎng)的微生物,應(yīng)該用點(diǎn)雜交的方法分析探針的特異性,來(lái)確定探針設(shè)計(jì)的合理性。此外,一些微生物本身具有熒光性,會(huì)對(duì)FISH檢測(cè)產(chǎn)生干擾。雖然自身熒光性有利于復(fù)染,但經(jīng)常降低信噪比,同時(shí)掩蓋特異的熒光信號(hào)。所以在處理一些混合菌群時(shí)要防止自身背景熒光的處理。使用狹窄波段的濾鏡和放大系統(tǒng)以及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理,可以降低背景熒光。Lin等發(fā)現(xiàn)用H2O2預(yù)處理可以有效的減少假陽(yáng)性。Taguchi等在使用FISH之前,用HCl預(yù)處理可以減少來(lái)自熒光標(biāo)記寡核苷酸探針?lè)翘禺愋晕盏谋尘盁晒庖约皽p少大量的雜質(zhì)。Hahn等發(fā)現(xiàn)用地高辛標(biāo)記探針原位觀察Frankiastrains與用熒光標(biāo)記探針相比,不產(chǎn)生自身熒光問(wèn)題。3.2熒光探針和多核苷酸探針的雜交雖然大多數(shù)細(xì)菌含有高的rRNA豐度,但rRNA豐度變異不僅僅發(fā)生在種屬間,亦發(fā)生在同一菌不同生長(zhǎng)階段,生長(zhǎng)率慢的細(xì)菌含有低的rRNA豐度;有些微生物細(xì)胞壁滲透性差,使探針不能充分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與rRNA分子雜交,這些都將導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此,優(yōu)化滲透性、用高亮度的熒光染料Cy3或Cy5和多重探針標(biāo)記,應(yīng)用信號(hào)放大系統(tǒng)或多核苷酸探針和CARD-FISH均可以增加雜交信號(hào)。Watt.等用FISH技術(shù)分析生長(zhǎng)小麥根系的土著細(xì)菌、假單胞菌、絲狀菌的量以及分布情況時(shí)發(fā)現(xiàn)使用Cy5或Cy5.5熒光染料可以避免在觀察時(shí)看到自身熒光。一些研究發(fā)現(xiàn)用多核苷酸熒光雜交技術(shù)和CARD-FISH均可以發(fā)現(xiàn)在水體中豐富的古生菌,而寡核苷酸熒光雜交技術(shù)無(wú)法發(fā)現(xiàn),表明寡核苷酸熒光探針的雜交信號(hào)較弱,通過(guò)其方法的改進(jìn),可以消除實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性。Sch?nhuber等發(fā)現(xiàn)用CARD-FISH比單熒光標(biāo)記的FISH熒光信號(hào)強(qiáng)20倍。4堆肥微生物生態(tài)學(xué)FISH技術(shù)在污水處理系統(tǒng)、濕地、湖泊、植物根系等環(huán)境領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用,而應(yīng)用于堆肥過(guò)程卻末見(jiàn)報(bào)道。目前傳統(tǒng)的微生物分離及鑒定技術(shù)只能得到堆肥樣品中微生物群落的一小部分(小于1%);脂肪酸譜圖法(PLFAs、WCFA-FAMEs等)和醌指紋法(QuinonesProfiling)都不能反映堆肥過(guò)程中具體哪個(gè)屬或哪個(gè)種的變化。相較之,FISH技術(shù)可以檢測(cè)出個(gè)體微生物的原位生理特性和功能,并實(shí)現(xiàn)在種屬水平上跟蹤堆肥過(guò)程中所有重要菌群的變化、演替規(guī)律,為堆肥技術(shù)和工藝的研究提供理論基礎(chǔ)。FISH技術(shù)也有其無(wú)法提供的微生物信息,必須與其他技術(shù)結(jié)合可為環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究提供更多的信息:①在堆肥和污水處理系統(tǒng)中熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTQ-PCR)與熒光原位雜交(FISH)技術(shù)結(jié)合能更好地揭示優(yōu)勢(shì)菌種數(shù)量變化與空間分布;②在堆肥處理過(guò)程中FISH技術(shù)與流失細(xì)胞儀相結(jié)合,評(píng)價(jià)和分析堆肥化過(guò)程的微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化,用以指示堆肥腐熟度;③活性污泥絮體或生物膜中特異化