小麥中dna重復(fù)序列的功能及應(yīng)用

小麥中dna重復(fù)序列的功能及應(yīng)用

1小麥基因組的組成與功能小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食之一，占世界人口的35%。小麥屬(Triticum)根據(jù)其基因組組成,可基本劃分為一粒系(einkorn)、二粒系(emmer)及普通系(dinkel)3個組。一粒系小麥為二倍體(2n=2x=14),主要包括:一粒小麥(Triticummonococcum)、野生一粒小麥(T.boeoticum)和烏拉爾圖小麥(T.urartu)3個種,它們的基本基因組均為A;二粒系小麥為四倍體(2n=4x=28),主要包括:圓錐小麥(T.turgidum,有6個亞種,基本基因組為AB)和提莫菲維小麥(T.timopheevi,有2個亞種,基本基因組為AG);普通系為六倍體(2n=6x=42),代表種是普通小麥(T.aestivum,ABD),也是最主要的栽培種,占小麥總播種面積的95%。大量研究表明,普通小麥?zhǔn)峭ㄟ^屬間天然雜交形成的異源六倍體,烏拉爾圖小麥提供了A基因組,擬斯卑爾脫山羊草(Aegilopsspeltoides,S)單獨(dú)或與其近親共同提供了B基因組,粗山羊草(Ae.squarrosa,D)貢獻(xiàn)了D基因組。就遺傳功能來講,A、B、D3個基因組非常相近,屬于同一部分同源群的染色體之間可以互相替代,產(chǎn)生正常結(jié)實的缺-四體。小麥3個基因組大小依此為B>A>D,與水稻基因組相比,A、B、D每個基因組的DNA含量分別是水稻的11～13倍,但水稻和小麥每個基因組的功能基因總數(shù)是相當(dāng)?shù)?這些編碼基因具有極高的同源性,在染色體上的排列次序也基本一致,造成這種DNA含量急增的主要原因是DNA重復(fù)序列的大量產(chǎn)生和擴(kuò)增,水稻基因組中50%的DNA為重復(fù)序列,而在小麥中這一指數(shù)高達(dá)83%。再如,在高粱中相距5kb的兩個編碼序列在玉米中相距達(dá)25kb,在玉米中這兩個基因之間無任何新基因插入,而是一些基因組特異的DNA重復(fù)序列。2重復(fù)序列家族在國外細(xì)胞中的作用重復(fù)序列又稱自私DNA(selfishDNA),Charlesworth等根據(jù)其拷貝數(shù)將重復(fù)序列劃分為:衛(wèi)星DNA(高度串聯(lián)重復(fù)序列)、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA(中度串聯(lián)重復(fù)序列)、轉(zhuǎn)座子(中度彌散、具轉(zhuǎn)座功能)。許多重復(fù)序列在近緣種甚至不同屬間是共享的,但在不同基因組中分布模式是不同的,最典型的例子是從黑麥中分離得到的pSc119.1pSc119.2(圖版-1～3),這類重復(fù)序列可能在小麥族植物的原始基因組中已經(jīng)存在;而有些重復(fù)序列是基因組甚至染色體特異的。根據(jù)重復(fù)序列在基因組中的分布方式,可分為串聯(lián)重復(fù)序列(tandemrepetitivesequence)和彌散重復(fù)序列(dispersedrepetitivesequence)。造成物種間串聯(lián)重復(fù)序列變異的主要遺傳機(jī)理是擴(kuò)增/缺失(amplification/deletion)、突變(mutation)和不等交換(unequalexchange)(圖1),彌散型主要是依靠轉(zhuǎn)座(transposition)、切除(excision)和異位交換(ectopicexchange)(圖2)。從進(jìn)化的角度看,物種間重復(fù)序列變異是自然選擇和生物對環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果,生物進(jìn)化的水平越高,重復(fù)序列占DNA總量的比重就越大,如噬菌體基因組中重復(fù)序列占10%、細(xì)菌為20%、酵母為30%、線蟲為60%,在人的基因組中這一指數(shù)高達(dá)90%。大部分重復(fù)序列無編碼功能,但也有一些重復(fù)序列具編碼功能,如所有高等生物的rDNA(18S-5.8S-26S)和組蛋白基因為串聯(lián)高度重復(fù)序列,谷類作物中編碼醇溶蛋白和谷蛋白的基因均為高度重復(fù)序列家族,在小麥中,編碼α-/β-醇溶蛋白的基因集聚于6A、6B及6D染色體的短臂上,編碼γ-/ω-醇溶蛋白的基因集聚于1A、1B、1D染色體的短臂上;而谷蛋白的編碼基因集聚于1A、1B、1D染色體的兩臂上;在玉米中,類似的高度重復(fù)序列家族位于第4和第7染色體上;在水稻中集聚于第5染色體上;在每一個基因內(nèi)部也含有數(shù)個編碼谷氨酸多肽片段的串聯(lián)重復(fù)序列。大量的研究資料表明,在谷類作物中編碼醇溶蛋白的基因是由同一個基因經(jīng)過重復(fù)和突變演化而來。重復(fù)序列在高等生物中的主要作用還有:(1)基因組分化:在多倍體物種中,重復(fù)序列的變化促使同源或部分同源的基因組向異源化方向發(fā)展,使這些物種減數(shù)分裂行為二倍(體)化,即在減數(shù)分裂終變期和中期,全部染色體配對形成二價體,極少或不形成多價體,從而保證了物種遺傳的穩(wěn)定性。Feldman等發(fā)現(xiàn),一些簡單的非編碼序列在小麥的3個二倍體祖先種中是共存的,然而在普通小麥中,這些序列從A、B、D的兩個基因組(至少一個)中消失;在人工新合成的多倍體小麥中,也證實一些原來是基因組間共享的簡單非編碼序列,在自交繁育過程中迅速從個別基因組中刪除,從而使同一部分同源群的染色體之間發(fā)生異化,以保證遺傳的穩(wěn)定性。我們在研究偃麥草屬植物基因組組成中發(fā)現(xiàn),當(dāng)兩個以上的基因組合并形成一個新物種后,一些序列可能會大量擴(kuò)增,這些序列大都位于染色體端部及著絲點附近,同時基因組間可能發(fā)生大量遺傳物質(zhì)的互滲,從而造成多倍體中的任一其因組不同于其二倍體祖先(圖版-4,5)。有關(guān)多倍體物種形成中,這類重復(fù)序列大量擴(kuò)增和互滲的機(jī)理還不十分清楚,但有一個十分可能的因素是轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的作用,研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)植物(包括水稻、大麥、小麥、玉米等)都攜帶反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列,在通常條件下,它們處于沉默狀態(tài),但在組織培養(yǎng)和遠(yuǎn)緣雜交后,很容易被激活,大量擴(kuò)增和轉(zhuǎn)座,使其在基因組中的拷貝數(shù)急劇增加。鮑文奎總結(jié)了40年小黑麥遺傳育種經(jīng)驗后,認(rèn)為無論選擇如何優(yōu)異、飽滿的雙親,新合成的八倍體小黑麥(ABDR)總是表現(xiàn)不出所期望的優(yōu)良性狀,種子飽滿度極難達(dá)到令人滿意的程度,必須對新物種(小黑麥)中的R基因組進(jìn)行多代的遺傳改造和選擇,才能使結(jié)實率和飽滿度得到顯著改善。他用混沌理論(chaostheory)來解釋上述現(xiàn)象。現(xiàn)在看來,由混沌到有序的過程與重復(fù)序列的變化調(diào)整是密切相關(guān)的。80年代,Gustafson等報道小黑麥種子皺癟與胚乳細(xì)胞旺盛分裂時期黑麥染色體端部異染色質(zhì)分裂異常密切相關(guān),而這些異染色質(zhì)區(qū)是高度重復(fù)序列的主要分布區(qū)。(2)轉(zhuǎn)座子(transponsons)和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransponsons):在高等生物中的一些中度重復(fù)序列內(nèi)通常含有轉(zhuǎn)座子,它們可將自己的拷貝插入到基因組中新的位置,轉(zhuǎn)座子的插入可引起許多突變,并伴有明顯的形態(tài)變化,甚至引起一些數(shù)量性狀的變化。在玉米中發(fā)現(xiàn)大量的轉(zhuǎn)座子實際就是重復(fù)序列,它們插入到基因間區(qū)甚至基因內(nèi)部,影響和調(diào)控這些基因的表達(dá);早期所觀察到的染色體鈕(chromosomalknob)實際是一些串聯(lián)重復(fù)序列的積聚區(qū)。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是借助于反轉(zhuǎn)錄酶大量復(fù)制自身的一類轉(zhuǎn)座因子,其內(nèi)部包含一個非常重要的基因,即反轉(zhuǎn)錄酶合成基因,它是從DNA到mRNA再到DNA轉(zhuǎn)座的關(guān)鍵因素。在水稻、大麥、小麥、玉米等都含有此類序列。最近在小麥的近緣植物黑麥中證實了反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的存在。Tomita從黑麥中克隆到一個以2.5kb為基本單位的重復(fù)序列家族,該序列在葉片中大量轉(zhuǎn)錄,并以RNA為介體,通過反轉(zhuǎn)錄大量擴(kuò)增;原位雜交顯示該重復(fù)序列為串聯(lián)重復(fù)家族,主要位于黑麥染色體端部。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活動是基因組分化的主要動力之一。(3)參與染色體聯(lián)會和配對:以TTTAGGG為基本重復(fù)單位形成的衛(wèi)星DNA存在于所有正常染色體的兩端,是端粒的主要組成之一,在維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、防止染色體錯配和非正常交換中起著舉足輕重的作用。丟失了端粒的染色體是極不穩(wěn)定的。在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂過程中,每條染色體的兩個端粒首先向相反的兩極附著在核膜上,然后才是染色質(zhì)的濃縮和配對。Hohmann等在研究端部富含異染色質(zhì)的小麥7A長臂時,發(fā)現(xiàn)7AL最頂端1%的缺失可導(dǎo)致該染色體臂配對頻率下降60%,而中部6%的缺失確只造成4.7%的下降。端部異染色質(zhì)在染色體配對和交換中的作用是顯而易見的。最新研究結(jié)果表明,在減數(shù)分裂過程中,同源染色體聯(lián)會最早(早前期)發(fā)生在著絲點區(qū)域,而著絲點也是重復(fù)序列的富集區(qū)(表)。3酶切后考察paesb52目前分離重復(fù)序列的主要方法有:(1)建立基因組DNA文庫,用相應(yīng)的基因組DNA作探針,對該文庫進(jìn)行篩選,再通過與基因組DNA的Southern雜交,檢測在不同基因組中的分布及相對豐度,這是獲得重復(fù)序列最常用的方法。(2)因為大部分RAPD產(chǎn)物為重復(fù)序列,對一些基因組特異的RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物克隆,用Southern雜交檢測在不同基因組中的分布和豐度。(3)克隆酶切殘余DNA(relicDNA),Bedbrook等最早使用此方法。殘余DNA是指不含六堿基限制性內(nèi)切酶切點的大分子量DNA。高度重復(fù)序列是用六堿基限制性內(nèi)切酶消化后殘留大分子量DNA片段的主要組成部分。因此,酶切并回收這些DNA片段,然后克隆篩選,是獲得DNA重復(fù)序列的一條捷徑。Salina等依據(jù)重復(fù)序列多含甲基化核苷酸的特點,先用對甲基化敏感的內(nèi)切酶HpaⅡ消化基因組DNA,回收大的片段(15kb以上),再用對甲基化不敏感的Taq1內(nèi)切、克隆獲得了擬斯卑爾脫山羊草特異的串聯(lián)重復(fù)序列spelt-1。(4)直接回收、克隆特異的酶切DNA片段,基因組DNA完全酶切,瓊脂糖凝膠電泳后,泳道中一些比較明亮的帶多為重復(fù)序列,回收、克隆這些特異片段是獲得串聯(lián)重復(fù)序列的一條有效途徑,pAesKB52就是通過這條途徑得到的。檢驗一個DNA片段是串聯(lián)重復(fù)序列還是彌散重復(fù)序列的最直接、準(zhǔn)確的方法是用該DNA片段做探針、進(jìn)行染色體原位雜交分析;與基因組DNASouthern雜交的帶譜也能在一定程度上反映該序列是串聯(lián)還是彌散分布。表中總結(jié)了在小麥族植物基因組中分布較廣、含量較高的一些串聯(lián)重復(fù)序列。4重復(fù)dns序列的配置4.1小麥b基因組起源的探討重復(fù)序列是在分子水平上研究物種起源和進(jìn)化最有效手段之一。幾乎所有的高等生物基因組中都含有一些物種或基因組特異(有)重復(fù)序列,研究這些序列在物種間,特別是在二倍體和多倍體物種間的變化,即可揭示在漫長進(jìn)化歲月中,物種間遺傳物質(zhì)交換和重組留下的歷史烙印。例如在很長一段時間內(nèi),科學(xué)家普遍相信在圓錐小麥(T.turgidum,AB)、提莫菲維小麥(T.timopheevii,AG)、普通小麥(T.aestivum,ABD)、茹可夫斯基小麥(T.zhuovskyi,AAG)中的A基因組均來自于一粒小麥(T.monococcum,Am),而Dvorak等用16個重復(fù)序列分析,結(jié)果清楚顯示,在上述多倍體小麥中,A基因組均由烏拉爾圖小麥(T.urartu,Au)提供,在茹可夫斯基小麥中的另一個A基因組是一粒小麥提供的。關(guān)于小麥B基因組的起源問題,本世紀(jì)30年代,Sears和Kihara等根據(jù)普通小麥與山羊草雜種染色體配對,提出小麥中的B基因組是由擬斯卑爾脫山羊草提供的,這一說法早期曾得到普遍認(rèn)同;但到80年代中后期,遇到了很多挑戰(zhàn)。因為擬斯卑爾脫山羊草的S基因組與小麥的B基因組在減數(shù)分裂中期Ⅰ不能配對形成7個完整的二價體,這可能與S基因組攜帶染色體配對調(diào)節(jié)基因有關(guān)。因為擬斯卑爾脫山羊草有3種類型:(1)攜帶Ph基因;(2)攜帶抑制Ph基因作用的基因;(3)中性類型。Ph基因又有明顯的劑量效應(yīng),不同類型的擬斯卑爾脫山羊草與小麥雜種染色體配對頻率和C值相差很大。對B基因組起源的另一看法(多源起源學(xué)說)是:擬斯卑爾脫山羊草、沙融山羊草(Ae.sharonensis,Ssh)、高大山羊草(Ae.longissima,Sl)、西爾斯山羊草(Ae.searsii,Ss)、二角山羊草(Ae.biconis,Sb)共同參與形成了小麥的B基因組。大量的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)證據(jù)證實擬斯卑爾脫山羊草是小麥B和G基因組的供體,至少是最主要的供體。只有全面、動態(tài)地看待和認(rèn)識重復(fù)序列在物種間的變化,我們才能得出比較可靠的結(jié)論。例如Salina等從擬斯卑爾脫山羊草中分離到一串聯(lián)重復(fù)序列家族spelt-1,該序列在擬斯卑爾脫山羊草中含量很豐富,而在一粒小麥、烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥、沙融山羊草等二倍體物種中含量甚微;在野生二粒、硬粒和提莫菲維等四倍體小麥中含量也很豐富,但在普通小麥中含量極低。我們不能僅基于上述事實就認(rèn)為普通小麥中的B基因組與野生二?；蛴擦Ｐ←溨械腂基因組是不同的。4.2建立染色體指紋圖譜在小麥遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程育種中,如何快速地鑒定出外源染色體片段和易位發(fā)生的準(zhǔn)確位置是一個非常具有現(xiàn)實意義的問題。經(jīng)典的方法是用成套的非整倍體如單體、端體等與研究對象進(jìn)行測交,分析雜種后代的染色體配對、并結(jié)合性狀分離來推斷易位發(fā)生的位置和外源片段的大小。其缺點是周期長、工作量大,而且最多只能定位到一個染色體臂上。建立染色體指紋圖譜可幫助我們對外源染色體片段進(jìn)行快速而直觀的物理定位,通過多色原位雜交,不僅可以檢測出外源遺傳物質(zhì),而且能夠?qū)ζ溥M(jìn)行準(zhǔn)確的染色體定位(圖版-3);同時,指紋圖譜的建立,為染色體物理圖譜的建立提供了許多重要的參照點,也為基因克隆奠定了一定基礎(chǔ)。目前染色體指紋圖譜繪制方法主要有兩條途徑,即染色體分帶和串聯(lián)高度重復(fù)序列的原位雜交。利用這兩種方法已建立了小麥B組和D組及黑麥和一些山羊草染色體的理想指紋圖譜。4.3采用x-射線衍射型高度重復(fù)序列法測定小麥染色體有可能導(dǎo)致外源遺傳變異在過去的15年中,有大量報道證明基因組DNA染色體原位雜交(GISH)是檢測和鑒定小麥或其它栽培作物背景下外源遺傳物質(zhì)的最有效手段。在GISH操作中,兩親遺傳關(guān)系越遠(yuǎn),封阻DNA需要量越少,而且很容易達(dá)到理想的信號強(qiáng)度,然而當(dāng)雙親的遺傳關(guān)系很近時,由于不同基因組之間DNA的交叉雜交(crosshybridization),GISH的分辨力就會受到很大影響和限制,甚至不能區(qū)分出外來染色體及其片段,此時用基因組特異的彌散型高度重復(fù)序列做探針,問題就會迎刃而解。例如孔秀英等分離得到尾狀山羊草(Ae.caudata,C)特異的彌散型高度重復(fù)序列(pAeca212),用它做探針可以清楚地檢測出小麥背景下的尾狀山羊草染色體及其易位片段;還可以彌散型重復(fù)序列為探針,通過Southern或點雜交檢測外源遺傳物質(zhì)。串聯(lián)重復(fù)序列在小麥染色體操作中也是非常有用的。例如誘導(dǎo)小麥染色體與外源染色體之間發(fā)生配對交換的一條有效途徑是消除或抑制Ph基因的作用,目前已獲得該基因的隱性突變體(ph1b、ph1c,均為缺失體),但在具體操作中,通常只能根據(jù)染色體配對頻率和紊亂程度判斷Ph基因位點是雜合還是純合,非常費(fèi)時。現(xiàn)在我們用pSc119.2做探針,通過原位雜交可很直觀地對Ph基因位點的遺傳變異類型作出診斷(圖版-3),提高操作效率。在利用Ph基因操作,將普通小麥1D染色體上的優(yōu)質(zhì)谷蛋白基因(5+10)轉(zhuǎn)移到硬粒小麥1A染色體、以便改進(jìn)硬粒小麥品質(zhì)和適口性研究工作中,利用pAs1在1A和1D染色體上的指紋圖譜,Vitellozzi等對易位發(fā)生位