不同茶葉兒茶素對(duì)腸道微生物菌群生長(zhǎng)的影響

不同茶葉兒茶素對(duì)腸道微生物菌群生長(zhǎng)的影響

茶是世界上最受歡迎的飲料之一。除了膾炙人口的色、香、味之外,飲茶可以有效的降低罹患各種疾病的風(fēng)險(xiǎn),例如癌癥、高血壓、高血脂等,而研究發(fā)現(xiàn)茶的風(fēng)味與保健功能正是茶葉所特有的茶多酚、茶氨酸等具有生物活性的成分所賦予的。近年來(lái),醫(yī)藥、健康研究領(lǐng)域開始越來(lái)越關(guān)注茶葉兒茶素體內(nèi)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生理活性,綜合目前已有的研究報(bào)道來(lái)看,茶葉兒茶素在體內(nèi)的代謝主要分為兩大部分,一是通過(guò)小腸壁吸收到人體內(nèi)循環(huán)的兒茶素的生物轉(zhuǎn)化,主要包括甲基化、糖基化和硫酸化;二是腸道中微生物對(duì)茶葉兒茶素的分解、代謝。由于茶葉兒茶素的生物利用率低,直接被小腸吸收的茶葉兒茶素只占人體攝入的茶葉兒茶素的少部分,可以推測(cè)人體攝入的茶葉兒茶素絕大部分進(jìn)入了大腸,并被腸道微生物分解、代謝,發(fā)揮生理作用。據(jù)報(bào)道富含多酚的藍(lán)莓水提取物在體內(nèi)可以發(fā)揮類似于益生元的作用,然而有關(guān)茶葉兒茶素對(duì)于腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用,目前還鮮有報(bào)道。近年來(lái),本課題組建立了茶葉兒茶素包括有抗過(guò)敏活性的甲基化兒茶素的分離、純化以及高效液相色譜(HPLC)分析方法,利用體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)與熒光原位雜交(FISH)技術(shù)分析鷹嘴豆α-低聚半乳糖對(duì)腸道菌群的影響。因此,本研究擬利用體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)方式對(duì)分離純化得到的茶葉兒茶素、甲基化兒茶素進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),通過(guò)FISH方法分析厭氧發(fā)酵過(guò)程中有益菌群(雙歧桿菌、乳酸菌)、有害菌群(擬桿菌、梭狀菌)以及總菌群的數(shù)量變化,研究其對(duì)于調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的作用,為茶葉兒茶素與甲基化兒茶素生理功能的闡明及其綜合利用提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1fish探針烏龍茶購(gòu)自廣東廣州市商場(chǎng)。ToyopearlHW-40S日本Tosoh公司;EGCG、ECG、EGC、EC標(biāo)準(zhǔn)品日本Funakoshi公司;無(wú)水乙醇及甲醇上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司;厭氧混合氣體(10%H2、10%CO2和80%N2)和高純N2南京特種氣體廠;4,6-聯(lián)瞇-2-苯基吲哚二鹽酸(DAPI)熒光染料德國(guó)Roche公司。表1所示的FISH專用16SrRNA寡合苷酸單鏈探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,序列5’端所接熒光基團(tuán)為吲哚二羧菁(Cy3),使用的探針是前人報(bào)道的文獻(xiàn)[14-17]中已經(jīng)成功使用、成熟的探針序列;(-)-表沒食子兒茶素3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯(EGCG3’’Me)及(-)-3-O-甲基-表兒茶素沒食子酸酯(ECG3’Me)標(biāo)樣根據(jù)周蓓等報(bào)道的方法制備。1.2儀器、試藥與儀器Agilent1100高效液相色譜儀(包括G1328B手動(dòng)進(jìn)樣器、G1311A四元泵、G1379A真空脫氣機(jī)、G1316A柱溫箱和G1315B二極管陣列檢測(cè)器(DAD))美國(guó)安捷倫公司;中壓色譜儀瑞士Büchi公司;Laborota4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國(guó)Heidolph公司;冷凍干燥機(jī)英國(guó)Labconco公司;AY-120電子精密天平、BL-220H分析天平日本Shimadzu公司;YQX-I厭氧培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;ZeissAxioImagerA1型熒光正置顯微鏡系統(tǒng)德國(guó)CarlZeiss公司。1.3方法1.3.1織物的提取、純化及上聚酰胺層析柱的制備稱取適量的粉碎茶樣,按照料液比1:20(m/V)加入熱水,在90℃恒溫振蕩器中振蕩提取40min,室溫條件下4500×g離心15min得上清液,茶渣用同樣方法再次浸提,合并兩次上清液并濃縮、凍干,得到茶多酚粗提物。將茶多酚粗提物制成一定質(zhì)量濃度的料液,經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后上聚酰胺層析柱(1.6cm×30cm)。首先用水洗去水溶性雜質(zhì),洗脫2BV(BV為柱床體積)后換用95%的乙醇洗脫,收集2BV洗脫液,濃縮,上ToyopearlHW-40S柱(5.0cm×50cm),用70%~90%的乙醇洗脫,采用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液(10mL/管),并利用HPLC分析洗脫液中兒茶素的組成,合并合適的組分,濃縮、凍干,得到各茶葉兒茶素樣品。1.3.2流動(dòng)相a/ch2cioh,phm采用HPLC外標(biāo)法測(cè)定分離純化得到的兒茶素樣品的純度。色譜條件:TSKgelODS-100Z色譜柱(4.6mm×150mm,5μm),柱溫40℃,檢測(cè)波長(zhǎng)280nm;梯度洗脫(流動(dòng)相A:CH3COOH,pH2.5;流動(dòng)相B:CH3OH),洗脫時(shí)間15min,流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)由82%降至40%,流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)由18%升至60%,流速1.0mL/min;進(jìn)樣量20μL。兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精確稱取各茶葉兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)品,溶解于水中,配制成一系列不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)0.45μm針頭式濾膜過(guò)濾后,按質(zhì)量濃度從低到高的順序進(jìn)行HPLC檢測(cè),記錄各個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的峰面積并以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖,得到各種兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.3合器振蕩一濕糞便樣本的收集與處理:收集受試者(受試者為3人,均為25~30歲之間健康人群,且在近2個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)抗生素)的新鮮全便,置于一次性硬質(zhì)無(wú)菌塑料袋中,封口后盡快存放于4℃冰箱。使用時(shí)混勻并稱取0.5g,加入4.5mL經(jīng)過(guò)濾、脫氧處理的PBS緩沖液,迅速置于厭氧培養(yǎng)箱中,經(jīng)旋渦混合器振蕩混勻3min,待用。體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)按照Manz等報(bào)道的方法進(jìn)行。首先稱取受試的茶葉兒茶素樣品溶解于高壓滅菌后的含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基:1L超純水含有蛋白胨2g、酵母膏2g、NaCl0.1g、K2HPO40.04g、MgSO4·7H2O0.01g、CaCl2·7H2O0.01g、NaHCO32g、氯化血紅素0.05g、L-半胱氨酸0.5g、膽汁酸鹽0.5g、吐溫-802mL、VK10μL;0.025g/100mL刃天青4mL)中,得到終質(zhì)量濃度為1g/1000mL的底物溶液。然后取糞便樣液(10%、pH7.3的PBS)150μL懸浮于1.35mL含有各種茶葉兒茶素樣品的底物培養(yǎng)基溶液中,混合均勻后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱(10%H2、10%CO2、80%N2)中,37℃發(fā)酵培養(yǎng)。在培養(yǎng)時(shí)間為0、6、12、24h時(shí)分別取100μL樣液,供細(xì)胞FISH計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù),對(duì)照為不加任何茶葉兒茶素的處理。1.3.4熒光光點(diǎn)檢測(cè)菌體計(jì)數(shù)采用FISH法。將300μL的多聚甲醛(pH7.2、4g/100mL)加入到100μL體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)發(fā)酵樣液中,置于4℃冰箱中冷藏16h,離心后用PBS緩沖液沖洗兩次,再用300μLPBS-酒精(體積比1:1)保存菌體。取菌體樣液10μL,滴入經(jīng)過(guò)鉻明膠溶液包埋過(guò)的載玻片圓孔內(nèi),平鋪于整個(gè)圓圈,在陰暗處自然風(fēng)干3h,然后用50%、80%、96%的乙醇溶液進(jìn)行連續(xù)脫水操作(各3min),自然風(fēng)干。將1μL50ng/μL的探針試劑與9μL雜交緩沖液加到載玻片的菌體試樣中,然后迅速將載玻片置入含有雜交緩沖液的濕盒中,根據(jù)探針類型采用不同溫度條件(探針Bif164:50℃,探針Lab158:45℃,探針Bac303:45℃,探針His150:50℃)雜交10h。雜交結(jié)束后,迅速用清洗緩沖液與超純水沖洗載玻片,在避光條件下自然風(fēng)干。測(cè)定總菌體數(shù)時(shí),將10μL1.25ng/μL的DAPI溶液加入到雜交后的載玻片上,保持5min,然后用超純水沖洗與自然干燥。所有樣品用ZeissAxioImagerA1型熒光正置顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行觀測(cè),采用AxioVision熒光成像軟件對(duì)每個(gè)試樣隨機(jī)選擇10~15個(gè)視野進(jìn)行拍照,記錄熒光光點(diǎn)。在對(duì)雜交后的各種菌體進(jìn)行拍照與熒光光點(diǎn)計(jì)數(shù)后,根據(jù)試樣質(zhì)量濃度以及稀釋倍數(shù)等計(jì)算出細(xì)菌總數(shù),并取其以對(duì)數(shù)(lg(細(xì)菌總數(shù)/mL))。1.3.5采用益生指數(shù)pi計(jì)算參考Palframan等的方法計(jì)算PI。1.3.6數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。2結(jié)果與分析2.1toypearlhw-40s層析分離茶多酚富含甲基化兒茶素的茶葉經(jīng)熱水浸提、濃縮和凍干,得到茶多酚粗提物。由于茶多酚粗提物含有一定量的多糖、咖啡堿等雜質(zhì),因此采用聚酰胺樹脂層析柱對(duì)其進(jìn)行分離純化。經(jīng)過(guò)聚酰胺樹脂柱層析分離之后,茶多酚含量提高到90%。由于ToyopearlHW-40S對(duì)于從茶多酚中分離茶葉兒茶素單體有著很好的效果,所以本實(shí)驗(yàn)將初步純化的茶多酚上ToyopearlHW-40S層析柱,進(jìn)行高純度EGCG和EGCG3”Me的樣品制備。通過(guò)70%~90%的乙醇洗脫,分別制備得到了純度30%EGCG3”Me的樣品、50%EGCG3’’Me的樣品、90%EGCG3”Me的樣品和90%EGCG的樣品。圖1為EGCG與EGCG3”Me的結(jié)構(gòu)圖。2.2不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)茶葉兒茶素增殖效果的影響由表2可知,與對(duì)照組相比,在不同的發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)不同茶葉兒茶素樣品對(duì)乳酸菌的增殖作用也呈現(xiàn)差異性,說(shuō)明茶葉兒茶素對(duì)于乳酸菌有著較好的增殖效果。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌的數(shù)量逐漸增多,發(fā)酵時(shí)間為6h與24h時(shí)各茶葉兒茶素樣品的增殖效果差異顯著。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24h時(shí),純度為90%的EGCG與純度分別為30%和50%的EGCG3”Me對(duì)于乳酸菌的增殖作用差異不顯著,而純度為90%的EGCG3”Me與其他樣品相比差異顯著,可以明顯的促進(jìn)乳酸菌的增殖。2.3不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)茶葉兒茶素增殖的抑制作用圖2C和圖2D分別為使用Bac303和His150探針對(duì)于不同茶葉兒茶素樣品經(jīng)厭氧發(fā)酵的樣液,經(jīng)FISH處理后熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果,表3為以不同茶葉兒茶素樣品為底物時(shí),不同發(fā)酵時(shí)間擬桿菌和梭狀菌的增殖情況。由表中可以看出,若樣品中不加任何茶葉兒茶素,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),擬桿菌的數(shù)量逐漸增多。與對(duì)照組相比,在不同的發(fā)酵時(shí)間點(diǎn),不同茶葉兒茶素樣品對(duì)擬桿菌增殖的抑制作用差異顯著。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),擬桿菌的數(shù)量逐漸減少,發(fā)酵時(shí)間為6h與24h的各兒茶素樣品具有差異顯著性,說(shuō)明兒茶素樣品對(duì)于擬桿菌的抑制作用明顯。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到24h時(shí),純度50%和90%的EGCG3”Me樣品差異不顯著,而純度為90%的EGCG3”Me與同樣純度的EGCG差異也不顯著。由表3可知,與對(duì)照組相比,在不同的發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)不同茶葉兒茶素樣品對(duì)梭狀菌增殖的抑制作用具有顯著差異。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),梭狀菌的數(shù)量逐漸減少,發(fā)酵時(shí)間為6h與24h的各茶葉兒茶素樣品的抑制效果具有差異顯著性。可以看出,EGCG和EGCG3’’Me都可以達(dá)到抑制梭狀菌增殖的效果,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到24h時(shí),純度50%和90%的EGCG3’Me樣品的效果差異不顯著,而純度為90%的EGCG3’’Me樣品的效果好于同樣純度的EGCG樣品的效果。2.4不同純度茶葉兒茶素對(duì)腸道內(nèi)總菌群的影響圖2E為使用DAPI熒光染料對(duì)不同兒茶素樣品經(jīng)厭氧發(fā)酵的樣液,經(jīng)FISH處理后熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果。由表4可以看出,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),腸道內(nèi)菌群的數(shù)量在慢慢增多,12h與6h具有差異顯著性,而24h時(shí)不同純度的茶葉兒茶素樣品與對(duì)照組相比對(duì)腸道內(nèi)總菌群的影響不顯著,說(shuō)明EGCG與EGCG3’’Me基本不會(huì)影響腸道內(nèi)總菌群的數(shù)量。結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出,茶葉兒茶素只是改變了腸道內(nèi)菌體的組成,對(duì)總體菌群的數(shù)量基本沒有影響。2.5不同純度的ecgg3’’me樣品的pi值變化由圖3可知,EGCG3’’Me的純度越高的樣品,其PI值越大,EGCG含量為90%的樣品和EGCG3’’Me含量為90%、50%、30%的樣品的PI值分別為1.86(24h)、2.68(6h)、2.25(6h)和2.14(6h),而對(duì)照組為0.12(12h)。在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn),各茶葉兒茶素樣品與對(duì)照組相比,PI值都具有顯著差異性(P<0.05);除了純度為30%的EGCG3’’Me在12h和24h的PI值差異不顯著(P>0.05)外,各茶葉兒茶素樣品之間的PI值在各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)其差異顯著(P<0.05)。對(duì)于不同純度的EGCG3’’Me樣品,其PI值在厭氧發(fā)酵6h時(shí)最大,而后降低,可能是由于一開始菌體的大量增殖使得體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量利用,后因營(yíng)養(yǎng)的缺乏導(dǎo)致部分菌體死亡,而純度為90%的EGCG樣品,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),其PI值逐漸增大。結(jié)合前面的分析可以得出,對(duì)照組對(duì)有害菌的增殖大于有益菌,而不同純度的茶葉兒茶素樣品對(duì)有益菌有較好的增殖作用,對(duì)有害菌有較好的抑制作用。在不同的厭氧發(fā)酵時(shí)間點(diǎn),各種純度的EGCG3’’Me樣品的PI值都大于純度為90%的EGCG;隨著純度的升高,EGCG3’’Me樣品的PI值也在增加,且差異顯著。Molan等報(bào)道藍(lán)莓多酚提取物能促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌在腸道內(nèi)的定殖,從而競(jìng)爭(zhēng)性的抑制病原菌在腸道內(nèi)的黏附、定殖和繁殖。一般而言,腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌數(shù)量的增加可以更加有效的減少氨、糞臭素及前致癌物質(zhì)的形成,增加有機(jī)酸的產(chǎn)生,降低結(jié)腸及糞便的pH值,抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖,從而改善腸道的微環(huán)境,促進(jìn)人體的健康。研究發(fā)現(xiàn)茶葉兒茶素能有效促進(jìn)有益菌的增長(zhǎng),同時(shí)抑制病原菌的增殖,因此茶葉兒茶素類物質(zhì),尤其是甲基化兒茶素,在腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)方面起到積極的作用。茶葉兒茶素發(fā)揮益生元功能,可能的機(jī)理是茶葉兒茶素作為抗氧化劑可以調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激,從而為腸道中有益菌生長(zhǎng)和繁殖提供更有利的環(huán)境。同時(shí),在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的短鏈脂肪酸能夠降低腸道的pH值,有效調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)環(huán)境,在促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的同時(shí),抑制有害菌的繁殖。3不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)茶葉兒茶素穩(wěn)定性的影響本研究以中國(guó)烏龍茶為原料,制備得到了高純度EGCG及不同純度的EGCG3’’Me樣品。體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,茶葉兒茶素樣品對(duì)雙歧桿菌、乳酸菌都有較好的增殖作用,并對(duì)擬桿菌、梭狀菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。甲基化兒茶素對(duì)腸道菌群的影響只是改變了腸道內(nèi)菌體的組成,對(duì)總體菌群的數(shù)量基本沒有影響;90%EGCG3