大鼠前列腺蛋白提純液聯(lián)合福氏完全佐劑致實驗性慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠模型的建立

大鼠前列腺蛋白提純液聯(lián)合福氏完全佐劑致實驗性慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠模型的建立

慢性非細(xì)菌前列腺炎（cap）是最常見的前列腺疾病。該病的就診患者約占泌尿外科門診總量的1/4。該病多發(fā)于20～40歲青壯年男性,病因尚不清楚,現(xiàn)在比較傾向于認(rèn)為它是一種自身免疫性疾病。目前臨床上仍然缺乏療效確切、持續(xù)、適應(yīng)范圍廣泛的治療方法。沒有一種合理的動物模型是阻礙新藥物、新療法研發(fā)進(jìn)程的因素之一。因此,本研究從制作CAP大鼠模型入手,力圖建立一種比較理想的CAP動物模型,并從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)角度對CAP病因病機(jī)進(jìn)行探討。1材料和方法1.1動物、試劑和機(jī)器1.1.1動物3月齡Wistar種大鼠,雄性,體重180～220g,共48只,由遼寧中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。1.1.2檢測試劑及檢測福氏完全佐劑(FCA):將液體石蠟與羊毛脂按2:1比例共熱至70℃混勻,高溫滅菌后按5mg/ml加入佐劑用卡介苗(購于中國生物制品檢驗所),無菌乳化后使用;百白破疫苗:沈陽市皇姑區(qū)衛(wèi)生防疫站提供;腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫測定試劑盒:由北京邦定泰克生物有限公司提供,批號:200211-15;誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)原位雜交檢測試劑盒:購自武漢博士德生物工程有限公司;BcaBESTRNAPCRKitVer.1.1:購自寶生物(大連)生物技術(shù)有限公司,批號:RR023CA;3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH):由遼寧中醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床檢驗中心病毒實驗室提供;DL-2000DNAMarker:購自寶生物(大連)生物技術(shù)有限公司;X174-HaeⅢDigestDNAMarker:購自寶生物(大連)生物技術(shù)有限公司;PCR引物:遼寧中醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床檢驗中心病毒實驗室合成,序列如下:1.1.3儀器和檢測方法分析天平(瑞士B6-EMETTLER);透射電鏡(日本JEM-100CXⅡ型);酶標(biāo)儀(美國Bio-RadBenchmark);電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝科器研究所DY89-I);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所JY92-II);蛋白核酸分析儀(美國貝克曼公司DU-600);PCR擴(kuò)增儀(美國PE公司PE9600);洗板機(jī)(美國Bio-Rad1575);恒溫箱(1815TC,SAEL-LAB);光學(xué)顯微鏡(日本OlympusCHK-213型);低溫高速離心機(jī)(德國HeraeusBiofuge28s。)1.2實驗方法1.2.1蛋白含量測定取240～300g雄性Wistar種大鼠10只,脫頸椎處死,在無菌條件下剝?nèi)∏傲邢俳M織,用冷生理鹽水洗凈,加入含0.5%TritonX-100的生理鹽水溶液,在冰水浴上用玻璃勻漿器制成勻漿,10000×g離心,30min,取上清液,用721分光光度計,以牛血清白蛋白溶液為標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,采用雙縮脲法進(jìn)行蛋白含量測定,最后用0.1mol/LpH7.2的PBS緩沖液稀釋為5、10、15mg/ml濃度。1.2.2fca乳劑對大鼠胰腺蛋白表達(dá)的影響,臨床組織化學(xué)成分檢測48只大鼠隨機(jī)分成正常對照組(n=12)、低劑量模型組(n=12)、中劑量模型組(n=12)及高劑量模型組(n=10)。除正常對照組外,其他各組均采用下述方法造模:大鼠乙醚麻醉,腹腔注射百白破疫苗0.5ml,多點皮內(nèi)注射大鼠前列腺蛋白提純液和FCA乳劑(比例為1∶1的混懸液)1.0ml,其中低劑量模型組大鼠前列腺蛋白提純液濃度為5g/L,中劑量模型組濃度為10g/L,高劑量模型組濃度為15g/L。正常對照組分別行腹腔及皮內(nèi)多點注射0.9%生理鹽水注射液0.5、1.0ml。以上各組均分別于0、30d2次注射。1.2.3提交材料1.2.3.1血液采集正常對照組、高劑量模型組大鼠分別于首次注射后45d采用乙醚麻醉,頸動脈取血,送檢ELISA法測定大鼠血清TNF-α含量。1.2.3.2.前組織取血后,同時斷頭處死其他各組大鼠,取前列腺組織送檢。1.2.4測試項目1.2.4.1一般病理觀察肉眼觀察實驗大鼠前列腺組織形態(tài),測定前列腺濕重和前列腺濕重/體重比等。1.2.4.組織病理學(xué)觀察將已用0.9%生理鹽水漂洗干凈的大鼠前列腺組織放入10%的中性甲醛溶液中固定,石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察實驗大鼠前列腺組織中實質(zhì)與間質(zhì)的病理變化。1.2.4.透射電鏡觀察將大鼠前列腺組織切成1mm×1mm×1mm的組織塊,投入2.5%戊二醛及1%鋨酸中雙重固定,乙醇、丙酮梯度脫水,Epon812環(huán)氧樹脂包埋,LKB超薄切片機(jī)切片,醋酸鈾、檸檬酸鋁雙重染色,透射電鏡觀察。1.2.4.吸光度值的計算測定大鼠血液樣本反應(yīng)后在波長490nm的吸光度值(A值)。所有A值減除空白值后進(jìn)行計算。根據(jù)樣品A值在該曲線上得出相應(yīng)TNF-α的含量。1.2.4.介素-1、il-2mrna及il-2mrna的檢測RT-PCR測定大鼠前列腺組織白介素-1β(IL-1β)、IL-2mRNA含量取50mg前列腺組織進(jìn)行檢測,觀察、計算結(jié)果并照相。1.2.4.6ins原位異交檢測標(biāo)本常規(guī)處理后光鏡下觀察,記錄并照相。iNOS原位雜交檢測結(jié)果的陽性反應(yīng)表現(xiàn)為出現(xiàn)棕紅色點狀顆粒。1.3統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;大鼠前列腺組織平均濕重、前列腺濕重/體重比等數(shù)據(jù)采用多組間方差分析檢驗;TNF-α值采用獨立樣本組間t檢驗。2結(jié)果2.1中劑量模型組與正常組濕重/體重比的比較高劑量模型組大鼠前列腺組織平均濕重、前列腺濕重/體重比與正常對照組相比均有明顯增加,差異有顯著性。中劑量模型組的前列腺濕重/體重比與正常對照組相比有差異,但其前列腺平均濕重與正常對照組比較,差異無顯著性。低劑量模型組各項相關(guān)指標(biāo)與正常對照組相比差異無顯著性。見表1。2.2中劑量模型組與正常對照組主要病理反應(yīng)及一定程度的慢性炎癥反應(yīng)正常對照組前列腺組織結(jié)構(gòu)完整,無炎性細(xì)胞浸潤或水腫;高劑量模型組大鼠的前列腺組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯異常:局部組織結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞,不均勻的組織增生或萎縮,導(dǎo)管擴(kuò)張或損毀,部分基膜被破壞,分泌物增多或減少,以及慢性炎癥表現(xiàn)(明顯的慢性炎性細(xì)胞浸潤,多為單核粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞),這些病理表現(xiàn)與正常對照組存在著明顯差異(圖1);中劑量模型組也出現(xiàn)了一些腺體結(jié)構(gòu)異常及一定程度的慢性炎癥表現(xiàn),但遠(yuǎn)不如高劑量組明顯。低劑量模型組與正常對照組的病理表現(xiàn)總體上相差不多。2.3各組細(xì)胞的組織病理表現(xiàn)正常對照組前列腺細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體小且數(shù)量較少,豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張成池;高劑量模型組的前列腺細(xì)胞呈明顯的高反應(yīng)表現(xiàn)(明顯的細(xì)胞核增大,異常豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重度擴(kuò)張成池,部分胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu),可見部分線粒體擴(kuò)張或呈空泡性改變;腺腔內(nèi)可見大量粗大的金屬樣分泌顆粒),這些病理表現(xiàn)與正常對照組間存在著明顯差異(圖2)。中劑量模型組也出現(xiàn)了一些高反應(yīng)腺體細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變,如:粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度擴(kuò)張,部分線粒體脹大,但無空泡性改變,結(jié)構(gòu)改變遠(yuǎn)不如高劑量組明顯。低劑量模型組與正常對照組的超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)則相差不多。2.4采用彈性法測定了大鼠血清tnf-f的含量本實驗中高劑量模型組TNF-α值明顯高于正常對照組,差異有顯著性。見表2。2.5il-1的實驗結(jié)果表明2.5.1il-1的rtpcr定性結(jié)果和分析高劑量模型組條帶強(qiáng)度高于正常對照組,高劑量模型組的IL-1β基因表達(dá)水平高于正常對照組。見表3及圖3。2.5.2il-1的rt-pcr半定量比較結(jié)果樣品、內(nèi)部高劑量模型組的半定量比值較正常對照組有所增高,高劑量模型組的IL-1β基因表達(dá)高于正常對照組。見表4及圖3。2.6不同劑量模型組il-2基因表達(dá)水平對臨床療效的影響高劑量模型組與正常對照組條帶相比,強(qiáng)度明顯增強(qiáng),高劑量模型組的IL-2基因表達(dá)明顯高于正常對照組,決定IL-2活性的炎性基因表達(dá)異常。見表5及圖4。2.7高劑量模型組大鼠炎性基因表達(dá)的比較中、低劑量模型組大鼠前列腺組織iNOS的表達(dá)強(qiáng)度與正常對照組相比雖有所增高,但程度明顯低于高劑量模型組。高劑量模型組表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)棕紅色顆粒較粗大,數(shù)量明顯增多,彌漫分布于整個胞質(zhì)內(nèi),其表達(dá)的強(qiáng)度明顯高于正常對照組及中、低劑量模型組,高劑量模型組的iNOSmRNA含量明顯增高,而且主要分布于胞漿內(nèi),該組大鼠的炎性基因表達(dá)明顯異于正常的,這可能是該組大鼠出現(xiàn)其他形態(tài)學(xué)表現(xiàn)異常的分子生物學(xué)機(jī)制之一(圖5)。3討論3.1炎性基因與cap發(fā)病的關(guān)系造成CAP的病因至今仍未明確,目前認(rèn)為最有可能導(dǎo)致CAP的病因是機(jī)體全身或局部原因所導(dǎo)致的免疫機(jī)能紊亂,這是目前CAP研究的熱點,也為大多數(shù)學(xué)者所接受。其中,可以引發(fā)免疫性炎癥反應(yīng)的炎性基因與CAP發(fā)病關(guān)系的研究日益受到重視。許多人類疾病的發(fā)生和發(fā)展可歸因于一些基因的異常表達(dá),炎性基因即是其中之一。一旦這些基因的轉(zhuǎn)錄活性出現(xiàn)異常,機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的生長調(diào)控等方面都將發(fā)生改變,如果這種變化超出了機(jī)體可以調(diào)控的范圍,就會對機(jī)體產(chǎn)生部位各異、程度不等的損傷。如果這種損傷發(fā)生在前列腺組織,就可能引發(fā)CAP。因此說TNF-α、IL-1β、IL-2、iNOS這些炎性基因的表達(dá)產(chǎn)物,連同NO,在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)以及CAP的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。3.2動物模型誘導(dǎo)目前國內(nèi)外關(guān)于慢性非細(xì)菌性前列腺炎動物模型的制備方法總體上分為兩大類:第一類是動物前列腺局部直接注射化學(xué)制劑,造成化學(xué)性無菌性的前列腺炎癥,如:角叉菜膠前列腺局部注射法、消痔靈前列腺局部注射法、甘油前列腺局部注射法、甲醛-巴豆油前列腺局部注射法、2%瓊脂糖前列腺局部注射法等;另一類是采用生物制劑、動物前列腺勻漿或其加工制劑來刺激造模動物,產(chǎn)生免疫應(yīng)答,在前列腺組織內(nèi)產(chǎn)生免疫性炎癥,如:同源性基因小鼠行前列腺勻漿輔以免疫佐劑皮下注射制備小鼠模型法、雌激素膠囊包埋誘導(dǎo)去睪丸大鼠法以及純化大鼠前列腺蛋白提取物化學(xué)修飾成分結(jié)合免疫佐劑皮內(nèi)注射制備大鼠模型法。其中第一類造模方法制作的動物模型,其發(fā)病機(jī)制是一種急性化學(xué)性炎癥,炎性病理反應(yīng)急促而劇烈,甚至出現(xiàn)前列腺組織的大范圍壞死,這些表現(xiàn)不僅與CAP的臨床表現(xiàn)不一致,病理表現(xiàn)具有很大差異,缺乏病理特異性,而且其發(fā)病機(jī)理也與目前對CAP研究所取得的基礎(chǔ)和臨床資料不一致,因而不是一種理想的CAP造模方法。因此,我們參照了第二類方法中Keetch與Maccioni等的造模與檢測方法,采用了前列腺蛋白提純液皮內(nèi)注射結(jié)合雙重免疫佐劑的方法進(jìn)行造模,并在國內(nèi)首次利用大體、光鏡、電鏡觀察,ELISA、RT-PCR以及iNOS原位雜交等方法,摸索這種造模方法的有效給藥劑量,而且進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)角度來探討大鼠前列腺蛋白提純液造成大鼠前列腺組織局部免疫性炎癥所表現(xiàn)出的特點。3.3elisa法測大鼠胰腺組織tnf-和il-2、inos活性的表達(dá)本研究觀察到,高劑量的大鼠前列腺蛋白提純液可以使大鼠前列腺產(chǎn)生明顯的大體病理學(xué)、組織病理學(xué)及電鏡所示的超微結(jié)構(gòu)改變,表現(xiàn)為:①高劑量模型組的前列腺組織平均濕重、前列腺濕重/體重比與正常對照組相比有明顯增加;②高劑量模型組的前列腺組織呈明顯的特異性炎性表現(xiàn),存在著明顯的組織缺損、破壞以及慢性炎癥表現(xiàn);③高劑量模型組前列腺細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)呈明顯的高反應(yīng)表現(xiàn),而且這些光鏡與電鏡病理表現(xiàn)與正常對照組間均存在著明顯差異。而應(yīng)用ELISA法測定大鼠血清TNF-α含量、半定量RT-PCR方法檢測大鼠前列腺組織IL-1β、IL-2含量以及原位雜交方法檢測前列腺組織iNOS活性的實驗結(jié)果也顯示出高劑量模型組的IL-1β、IL-2以及iNOS的基因表達(dá)明顯高于正常對照組,這一結(jié)果表明決定IL-1β、IL-2、iNOS活性的炎性基因表達(dá)存在異常,這與Harris等的實驗結(jié)果是吻合的。這些結(jié)果表明,該模型大鼠的前列腺組織出現(xiàn)了慢性炎癥的病理變化,與CAP病理變化類似,同時其他學(xué)者的相關(guān)研究表明,這類造模方法僅引起前列腺組織局部的病理改變,而不會引起其他臟器的自身免疫反應(yīng),說明該方法還具有較好的特異性。本實驗中高濃度的大鼠前列腺蛋白提純液是造成CAP模型的有效劑量,而中、低劑量組未表現(xiàn)出明顯改變,說明這兩種劑量不足以明確地造成該動物模型。本研究中形態(tài)學(xué)上所表現(xiàn)的異常則提示以上提及的分子生物學(xué)表現(xiàn)的異?？赡軙?dǎo)致前列腺組織局部偏離免疫穩(wěn)態(tài),呈現(xiàn)出免疫亢進(jìn)的狀態(tài),而這種超出機(jī)體調(diào)控范圍的免疫攻擊可以對前列腺組織細(xì)胞造成炎癥性損傷,這在臨床上即可引發(fā)各種癥狀,導(dǎo)致CAP的發(fā)生。3.4tri能力的測定實驗中應(yīng)該注意:剝離前列腺組織時應(yīng)盡可能把前列腺周圍組織剔除干凈,以利于抗原制備的純化。在蛋白制備過程中應(yīng)保持無菌操作。使用內(nèi)皮細(xì)胞損傷