血清葡萄糖常用檢測方法

血清葡萄糖常用檢測方法

葡萄糖（c6h12o6）是最常見的未經(jīng)處理的單糖，也被稱為葡萄糖右旋糖，屬于乙醇類。葡萄糖的分子結(jié)構(gòu)是19世紀(jì)德國化學(xué)家費(fèi)歇爾測定的。葡萄糖分子中含有6個(gè)碳原子,是一種己糖,分子中含有醛基(-CHO),具有還原性,因此葡萄糖是一種還原性的糖,易溶于水。葡萄糖存在于人體的血漿和淋巴液中,是生命活動(dòng)中不可缺少的物質(zhì),它在人體內(nèi)能直接參與新陳代謝過程。在消化道中,葡萄糖比任何其它單糖都容易被吸收,而且被吸收后能直接被人體組織利用。人體攝取的低聚糖(如蔗糖)和多糖(如淀粉)也都必須先轉(zhuǎn)化為葡萄糖之后,才能被人體組織吸收和利用。血清葡萄糖(Bloodglucose,簡稱GLU)即血清中所溶解的葡萄糖,人體中血清葡萄糖的正常值為7.5×102～1.0×103mg/L,當(dāng)其值高于1.3×103mg/L時(shí)可診斷為高血糖,低于5.0×102mg/L可診斷為低血糖。血清葡萄糖是臨床生化檢驗(yàn)中的重要指標(biāo),是維持生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì),其含量會(huì)因病態(tài)的不同而有所變動(dòng)。在臨床上,由于血糖濃度是許多疾病的病癥診斷、鑒別診斷、病情觀察、治療監(jiān)控和疾病預(yù)防等必不可少的首選指標(biāo),因此,對(duì)其準(zhǔn)確測定具有重要意義。1微生物的檢測方法目前,血清葡萄糖常用的檢測方法主要有氧化酶-偶聯(lián)比色法、微電流法、氧速率法、已糖激酶法、鄰甲苯胺法、葡萄糖脫氫酶法、氣相色譜/同位素稀釋質(zhì)譜法、微創(chuàng)測定法等。下面就這些方法進(jìn)行簡要介紹。1.1葡萄糖氧化酶氧化酶-偶聯(lián)比色法通常在臨床上簡稱氧化酶法,其反應(yīng)原理是利用葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase,簡稱GOD)氧化葡萄糖時(shí)產(chǎn)生H2O2,在過氧化酶(POD)存在時(shí)把還原型生色原氧化成氧化型生色原,其產(chǎn)量與血糖濃度成正比。通過測量光的吸收強(qiáng)度,可計(jì)算出血液葡萄糖的濃度。氧化酶法由于操作簡便,試劑來源廣泛,價(jià)格便宜,不需要專用的儀器,成本低,以這種方法為原理制成的血糖儀用血量少,檢測速度快,尤其是糖尿病患者可隨身攜帶,是我國衛(wèi)生部推薦的血糖測定的常規(guī)方法。氧化酶法中,雖然葡萄糖氧化酶僅對(duì)β-D-葡萄糖氧化,但由于過氧化酶特異性差,從理論上看,尿酸、維生素C、膽紅素等可與色原性物質(zhì)競爭過氧化氫而抑制反應(yīng),引起結(jié)果偏低,且此法線性范圍較窄(0.1～20.0mmol/L)。葡萄糖氧化酶對(duì)β-D-葡萄糖高度敏感。葡萄糖溶液中有α型及β型兩種葡萄糖,葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的轉(zhuǎn)化。新配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液主要是α型葡萄糖,必須放置2h以上(最好過夜)待其變旋平衡后方可應(yīng)用。1.2氧化酶檢測血液微電流法的檢測原理是在電極表面固化GOD,當(dāng)血液滴到電極上時(shí),葡萄糖氧化酶可氧化血液中的葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖內(nèi)酯和H2O2,同時(shí)釋放出電子。所產(chǎn)生的電子被導(dǎo)電介質(zhì)轉(zhuǎn)移給電極,在一定電壓作用下,流過電極的電流將發(fā)生變化,通過檢測電流變化與葡萄糖濃度的線性關(guān)系達(dá)到檢測血糖濃度的目的。1.3精密度和準(zhǔn)確度氧速率法又稱氧電極法,其原理是測定溶液中氧的消耗,根據(jù)從酶反應(yīng)開始至結(jié)束的氧濃度差,求得標(biāo)本中葡萄糖濃度。氧電極置于含有適量葡萄糖氧化酶的溶液中,當(dāng)加入樣品后,樣品中的葡萄糖被氧化而消耗氧。由于氧消耗量與血清中的葡萄糖濃度成正比,而電極的極限擴(kuò)散電流(IM)又與溶液中氧含量成正比,因此,氧電極IM值即可反映樣品中血清葡萄糖的濃度。氧速率法的精密度好、準(zhǔn)確性高,且具有極高的抗特異性。該法中氧電極只監(jiān)測高度特異的葡萄糖氧化酶催化反應(yīng),且電極檢測到的是樣本的最大氧消耗速率,因而它不受大氣中氧的干擾,也不受溶血黃疸、乳糜和其它代謝物的干擾,其測定結(jié)果與參考方法最接近;由于氧速率法的使用,血糖的結(jié)果可以在加入樣本20s后獲得,大大地提高了檢測速度。該法的不足之處是需要特殊儀器反應(yīng)槽和電極,只能測定葡萄糖含量,不能測定其它項(xiàng)目;由于氧電極膜具有一定壽命,使用一段時(shí)間后,膜的老化使其對(duì)氧通透性降低,靈敏度下降,檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度也隨之下降。1.4己糖激酶法檢測血清中葡萄糖、糖酸、酯類物質(zhì)己糖激酶在ATP存在時(shí)能催化葡萄糖變成6-磷酸葡萄糖和ADP,6-磷酸葡萄糖在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化態(tài),NADP)存在的情況下,由6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化生成6-磷酸葡萄糖酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(還原態(tài),NADPH),后者在340nm處有一吸收峰,其峰值的高低與葡萄糖含量成正比。己糖激酶法測定血清中葡萄糖具有輕度溶血、脂血、黃疸,維生素C、氟化鈉、肝素、EDTA和草酸鹽等不易干擾本法測定,適用于自動(dòng)分析儀,是目前國際上公認(rèn)的參考方法。但從紅細(xì)胞中釋放出的有機(jī)磷酸酯和一些酶能消耗本法中NADP,對(duì)該法有干擾。另外,HK法的測定成本較高。1.5綠色化合物的檢測葡萄糖與鄰甲苯胺在熱的乙酸溶液中,葡萄糖的醛基與鄰甲苯胺縮合、脫水,生成希夫氏堿,經(jīng)分子重排等反應(yīng)生成藍(lán)綠色化合物,在630nm處有最大吸收峰,其峰值的高低與葡萄糖含量成正比。該方法操作簡單,特異性較高,結(jié)果較準(zhǔn)確。目前在教學(xué)實(shí)驗(yàn)或規(guī)模較小的基層醫(yī)院用于測定血糖,但使用試劑中的鄰甲苯胺具有毒性,冰乙酸有較強(qiáng)的刺激氣味,對(duì)人和儀器都會(huì)產(chǎn)生很大的影響。此外,其它糖在反應(yīng)過程中亦能產(chǎn)生有色化合物,對(duì)測量結(jié)果產(chǎn)生一定的偏差。1.6煙酰胺腺呤二核苷酸還原態(tài)的性質(zhì)葡萄糖脫氫酶催化葡萄糖脫氫,氧化生成葡萄糖酸內(nèi)酯,向反應(yīng)液中加入變旋酶可縮短反應(yīng)到達(dá)平衡的時(shí)間。在反應(yīng)過程中,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(還原態(tài),NADH)的生成量與葡萄糖濃度成正比關(guān)系。因此,可根據(jù)測定生成物的吸光度確定。據(jù)報(bào)導(dǎo),當(dāng)葡萄糖濃度在20.0mmol/L以下時(shí),NADH的生成量與葡萄糖的濃度呈良好的線性關(guān)系。但是,目前由于GDH法價(jià)格昂貴而尚未被普遍采用。1.7血清中葡萄糖的測定方法1995年國際物質(zhì)量咨詢委員會(huì)(CCQM)在巴黎召開的第六次會(huì)議,將同位素稀釋質(zhì)譜法(Isotopedilutionmassspectrometry,IDMS)、精密庫侖、電位滴定、凝固點(diǎn)下降和重量法定位于具有絕對(duì)測量性質(zhì)的方法。其中,ID/MS是唯一一種微量、痕量和超痕量物質(zhì)含量的權(quán)威測量方法。近年來,IDMS是最常用的臨床檢驗(yàn)量值的基準(zhǔn)方法。通過向樣品溶液中加入一種同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)物,在溶質(zhì)與標(biāo)記物溶液充分平衡以后,對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,利用GC或LC-MS測定標(biāo)記物與溶質(zhì)的峰強(qiáng)度比來測定溶質(zhì)的濃度。該法具有特異性高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。目前國際上正利用IDMS作為基準(zhǔn)方法為人體血清中的膽固醇、葡萄糖、尿酸、尿素、肌酐以及甘油三酯等定值。E.WhiteV等人將一定量的13C-葡萄糖溶液加至血清樣品中,用80%的乙醇除去蛋白,振蕩,離心;取上清液,在蒸發(fā)器中除去乙醇后,加入1-丁基-硼酸的吡啶溶液,95℃加熱35min;加入乙酸酐反應(yīng)1h;生成物在真空條件下干燥一夜后,加入異辛烷將殘留物復(fù)溶,進(jìn)行GC-MS分析,因此而建立了血清中葡萄糖的高準(zhǔn)確度測量方法,同時(shí)還研制了血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM965a。Hannestad等人將一定量的13C-葡萄糖溶液加至血清樣品中,用甲醇除去蛋白,放置30～40min,離心;取上清液,50℃氮?dú)獯蹈?加入鹽酸羥胺的吡啶溶液,90℃加熱40min,冷卻;加入乙酸酐,90℃加熱1h;氮?dú)獯蹈?加入氯仿復(fù)溶,進(jìn)行GC-MS分析。1.8血糖濃度檢測由于取血必須用針,因而有痛,故近年發(fā)展起來的微創(chuàng)測定法也頗受研究者的青睞。微創(chuàng)測定法是一種利用傳感器測定血清葡萄糖的新技術(shù)。這種技術(shù)可不直接穿透皮膚進(jìn)入體內(nèi)采血,而是通過接觸或遙感身體的某個(gè)部位,通過對(duì)選擇性信號(hào)的處理(這些信號(hào)主要通過皮下組織層、真皮、表皮等的傳輸或反射)來測定血糖濃度。這種方法不使用尖銳器具和生物危害材料,大大減輕了患者的痛苦,可以增加對(duì)患者的檢查頻率,因而可以更緊密的關(guān)注其血糖濃度。目前我國在這方面研究較薄弱,有待進(jìn)一步加強(qiáng)。2關(guān)于血清中葡萄糖的基準(zhǔn)方法與參考系統(tǒng)從上述GC-IDMS方法的發(fā)展可以看到,美國、歐盟等國家針對(duì)血清中葡萄糖的基準(zhǔn)方法及參考方法開展了廣泛深入的方法研究,取得了較大的進(jìn)展,同時(shí)研制了血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。我國臨床檢驗(yàn)量值溯源性基礎(chǔ)研究目前處于初始階段,與美國、歐盟的研究水平差距很大。國內(nèi)針對(duì)葡萄糖的高準(zhǔn)確度定值方法和血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究尚未見報(bào)道,因此我國還沒有建立血清中葡萄糖的基準(zhǔn)方法和參考系統(tǒng)。在目前全球改進(jìn)醫(yī)學(xué)測量準(zhǔn)確度,建立全球認(rèn)可的體外診斷參考系統(tǒng)的形勢(shì)下,建立我國的參考系統(tǒng)非常迫切。中國計(jì)量