曲克蘆丁中羥乙基蘆丁衍生物的測定

曲克蘆丁中羥乙基蘆丁衍生物的測定

特洛伊木馬是羥乙基化半合成的產(chǎn)物。它可以降低毛細(xì)管的滲透性和脆弱性，抑制血小板聚集，防止血栓形成。這是治療閉塞性腦病的常用藥物。由于蘆丁有四個酚羥基,經(jīng)羥乙基化后可形成十余種羥乙基和位置不同的衍生物。各衍生物間性質(zhì)接近,難以分離、純化。目前生產(chǎn)和使用的曲克蘆丁為以三羥乙基蘆丁[3′,4′,7-三(2-羥基乙基)蘆丁]為主的羥乙基蘆丁混合物,其它成份有單羥乙基蘆丁、二羥乙基蘆丁、三羥乙基蘆丁異構(gòu)體和四羥乙基蘆丁等。以上成份作為其它羥乙基蘆丁衍生物,在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中需要加以控制。曲克蘆丁的分離測定方法主要有薄層色譜法和高效液相色譜法。在四川、山東等多個省、區(qū)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中收載有曲克蘆丁,但其它羥乙基蘆丁衍生物的檢查僅山東省藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中收載。德國藥典[DAB(1997)]采用HPLC法檢查曲克蘆丁中其它羥乙基蘆丁衍生物,采用填料粒度為4μm的ODS柱,流動相為乙腈-0.1mol·L-1的磷酸二氫鈉(2∶8),紫外350nm檢測。填料粒徑為4μm的色譜柱價(jià)格昂貴。經(jīng)試驗(yàn),改用常用的5μm填料的色譜柱,峰明顯擴(kuò)寬,分離度變差。采用高效液相色譜法檢查曲克蘆丁中其它羥乙基蘆丁衍生物,國內(nèi)未見報(bào)道。為控制曲克蘆丁中其它羥乙基蘆丁衍生物的量,建立了檢查曲克蘆丁原料藥中其它羥乙基蘆丁衍生物的高效液相色譜法。本法不需使用特殊的色譜柱,方法簡便、精密度好,適用于常規(guī)分析。1實(shí)驗(yàn)部分1.1色譜數(shù)據(jù)處理日本島津LC-10A液相色譜儀,SPD-10A紫外-可見檢測器,C-R7A色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)。乙腈為色譜級;四氫呋喃為分析純,經(jīng)重蒸處理;水為重蒸餾水;其它試劑均為分析純。曲克蘆丁原料藥(四川協(xié)力制藥有限公司)。1.2方法和結(jié)果1.2.1不同雜質(zhì)峰的確定用TLC法制備部分雜質(zhì)的對照品。參照DAB(1997)TLC法鑒別中各雜質(zhì)的Rf值,收集有關(guān)斑點(diǎn),以甲醇-水(1∶1)洗脫,采用相同的色譜條件分析,確定保留時(shí)間6.2min的峰為四羥乙基蘆丁,主峰三羥乙基蘆丁的保留時(shí)間為17.2min,保留時(shí)間19.3min和20.7min的峰為三羥乙基蘆丁異構(gòu)體,其它雜質(zhì)峰尚待確定。1.2.2系統(tǒng)的適用性1.2.3試驗(yàn)溶液的制備1.2.4精密度測試1.2.5分離效果的檢驗(yàn)由表2、圖2可以看出,在不同的色譜柱上,均可得到滿意的分離效果。在選定的色譜條件下,取供試品溶液4、6、8、10μl進(jìn)樣,測定峰面積值,按峰面積歸一化法計(jì)算各組份的相對含量(表3)。1.2.6樣品的質(zhì)量分析2色譜柱的確定和色譜圖的設(shè)置2.1由于測定組份的水溶性很強(qiáng),于流動相中加入適當(dāng)比例四氫呋喃,可增強(qiáng)組份在固定相上的保留,有利于三羥乙基蘆丁和其后相關(guān)物質(zhì)峰的分離;三羥乙基蘆丁及相關(guān)物質(zhì)有酚羥基,具有一定酸性,在流動相中加入一定量的磷酸二氫鈉,并調(diào)至酸性,有利于改善峰形,提高柱效。用二極管陣列檢測器(DAD)檢測,測定各組份的紫外吸收光譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn),三羥乙基蘆丁及其它羥乙基蘆丁衍生物在紫外254nm和350nm處均有最大吸收,采用350nm檢測可減少其它物質(zhì)的干擾。2.2經(jīng)試驗(yàn),進(jìn)樣量在2～10μg范圍內(nèi),三羥乙基蘆丁及其它羥乙基蘆丁衍生物的相對含量的精密度好,三羥乙基蘆丁峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系,回歸方程為:A=0.2031x-0.0598,r=0.9999。因此,以上色譜條件也可用于曲克蘆丁原料藥的含量測定。2.3三羥乙基蘆丁與其后雜質(zhì)峰的分離效果與保留時(shí)間有關(guān),保留時(shí)間過短,分離變差。因此,采用不同的色譜柱測定時(shí),適當(dāng)調(diào)整流速,使主峰的保留時(shí)間在17～20分鐘。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)后選定的色譜條件為:日本島津Shim-packCLC-ODS柱(150mm×6.0mm,5μm),預(yù)柱為PhenomenexODSGuardCartridgeSystem(4.0mm×3.0mm);流動相為乙腈-四氫呋喃-0.05mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(5∶8∶87),用磷酸調(diào)pH4.0,調(diào)整流速,使曲克蘆丁峰的保留時(shí)間為17～20min,紫外350nm檢測。在此條件下曲克蘆丁原料藥的色譜圖見圖1。按曲克蘆丁峰計(jì)算,柱效為7.5×103;曲克蘆丁與其前雜質(zhì)峰的分離度為3.4,與其后雜質(zhì)峰的分離度為1.5,在選定的條件下,曲克蘆丁和有關(guān)物質(zhì)的峰可以完全分離。精密稱取供試品約50mg,精密加入流動相50ml,振搖使溶解,溶液如不澄清,濾過,取續(xù)濾液備用。取供試品溶液10μl,重復(fù)進(jìn)樣六次,測定三羥乙基蘆丁、四羥乙基蘆丁和其它三個主要羥乙基蘆丁衍生物的峰面積,峰面積的RSD為重復(fù)進(jìn)樣的精密度;在同一天內(nèi)于0、2、4、6、8h進(jìn)樣一次,峰面積值的RSD為日內(nèi)精密度(表1)。為考察色譜柱對分離的影響,在選定的流動相下,使用三種不同的色譜柱:島津ShimpackCLC-ODS柱(150mm×6.0mm,id),流速為1.0ml·min-1;WatersSpherisorbS5ODS柱(250mm×4.6mm,id),流速為0.8ml·min-1;Luna5μC18柱(150mm×4.6mm,id),流速為0.6ml·min-1,分別測定同一批樣品,色譜圖見圖2,測定結(jié)果見表2。精密稱取曲克蘆丁原料藥50.0mg,精密加入