液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定曲克蘆丁血藥濃度的不確定度評定

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定曲克蘆丁血藥濃度的不確定度評定

根據(jù)中國實驗室國家認可委員會制定的《分析不確定度的評估指南》，化學檢驗部門應在實施清晰度標準時，向檢測結(jié)果提供不確定度。一個完整的定量分析結(jié)果,不但包括測量值,還包括測量不確定度,其大小決定了測量結(jié)果的實用價值。ISO17025要求,合格的分析實驗室的每個證書或報告,都應該包含有關校準或測試結(jié)果不確定度評定的說明。不確定度對于控制實驗質(zhì)量和優(yōu)化實驗方法具有非常重要的意義。為此本文對LC-MS/MS檢測曲克蘆丁血藥濃度的方法進行不確定度評定,控制分析方法的關鍵步驟,減小不確定度,為方法學研究提供有益的指導。材料和方法1試劑:merk公司曲克蘆丁滴丸,規(guī)格:每粒10mg,批號:071007;曲克蘆丁片,規(guī)格:每片60mg,均由南京天澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司提供;內(nèi)標:芍藥苷,批號:110736,中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇,色譜純,Merk公司生產(chǎn);試驗用水均為去離子水;其余試劑均為分析純。MicromassQuattromicroLC-MS/MS聯(lián)用儀,包括自動進樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、2695液相色譜儀和Masslynx4.0質(zhì)譜工作站,美國Waters公司產(chǎn)品;BS124S電子天平,德國Sartorrius公司產(chǎn)品;Micromax3591臺式高速離心機,賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。2血漿樣本的測定2.1檢測離子msr色譜條件:色譜柱為HanbonKromasilC18(2.1mm×150mm,5μm);流動相為0.02%甲酸的水溶液-甲醇(55∶45);流量0.2mL·min-1;柱溫40℃。離子檢測方式為MRM多反應離子監(jiān)測;離子化方式:氣動輔助電噴霧離子化(ESI+)。曲克蘆丁:[M+Na]+峰m/z765.5,子離子m/z457.1;芍藥苷:[M+Na]+峰m/z503.4,子離子m/z219.1。2.2固相萃取小柱的制備于2mL離心管中精密加入血漿樣品1mL,內(nèi)標溶液10μL,渦旋30s,加入10%高氯酸600μL,渦旋1min,于15000r·min-1室溫離心5min。吸取上清液至10mL離心管中,加入pH7.00的磷酸鹽緩沖液1.4mL,渦旋30s。用甲醇1mL活化固相萃取小柱,再用pH7磷酸鹽緩沖溶液1mL平衡小柱。將混合后的溶液上樣后,用5%甲醇水溶液1mL淋洗,洗脫液棄去,最后用含1%甲酸的甲醇溶液0.5mL洗脫,洗脫液收集至10mL離心管中,經(jīng)40℃空氣流吹干后,用甲醇-水(50∶50)溶液80μL復溶,15000r·min-1離心5min,取上清溶液,進樣10μL。2.3標準含藥血漿的制備稱取曲克蘆丁10mg,置于10mL容量瓶中,加入純水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得1mg·mL-1曲克蘆丁的儲備液。取儲備液25μL加入純水定容至10mL得2.5μg·mL-1標準溶液。取2.5μg·mL-1標準溶液400μL,加入純水稀釋至10mL容量瓶,配成濃度為100ng·mL-1的曲克蘆丁標準溶液。取2mL離心管,精密加入曲克蘆丁100ng·mL-1標準貯備液10μL及空白血漿1mL,渦旋混勻,得1ng·mL-1的標準含藥血漿。加入內(nèi)標10μL。3血樣量化療效標準根據(jù)文獻方法按照以下4個步驟進行:①規(guī)定被測量;②識別不確定度來源;③不確定度分量的量化,包括:標準溶液配制引入的不確定度、標準曲線擬合的不確定度、提取回收率、重復性;④計算合成不確定度,對濃度為1ng·mL-1的血樣,進行不確定度評估。其中,標準物質(zhì)純度引入的不確定度符合三角分布。標準曲線的不確定度采用加權(quán)方法來計算。結(jié)果1不確定因素的原因根據(jù)檢測過程分析,評定其中主要來源,見圖1。2不確定組件對各不確定度分量作圖,見圖2。由圖2可見,提取回收率和標準曲線是本實驗結(jié)果不確定度的主要分量。3擴展不確定度評定將各分量按照不確定度傳播律合成:Urel=0.26。取包含因子k=2,則相對擴展不確定度:UrelEErel=U×k=0.52,擴展不確定度:UE=UrelEErel×C=0.53ng·mL-1。不確定度的來源評定不確定度的方法有自底向上(bottom-up)法、自上向下(top-down)法、基于方法學驗證(validation-based)方法、擬合方程(Fitness-function)法等。本文用方法學驗證數(shù)據(jù)和自底向上相結(jié)合的方法,對體內(nèi)藥物的不確定度評估。結(jié)果表明,提取回收率和標準曲線是最主要不確定度分量。其中,因標準曲線分量依賴于濃度范圍和重復次數(shù),在實際操作中,主要考慮前處理過程的不確定度,前處理不確定度還可以再繼續(xù)細化,以找出影響這一步驟的較大因素,優(yōu)化前處理方法,使測定結(jié)果更準確可靠。本實驗中這一分量主要來源于固相萃取(SPE),而影響SPE的重復性的因素很多,包括固相小柱的類型、批次、柱的制備,以及沖洗、洗脫、吹干、復溶等一系列環(huán)節(jié)。這些不確定度可用靈敏系數(shù)來定量。文獻報道,用PB設計,即每個因素選高低2水平,k個因素有2k次試驗,將各因素高低水平結(jié)果的平均均值相減,可篩選出主要影響因素。若對前處理過程的影響因素,采用PB設計,繼續(xù)進行實驗,有可能找出前處理過程中的最主要不確定度來源。方法驗證中的精密度和不確定度都可表示為95%的置信區(qū)間,但2者內(nèi)涵不同。對同一實驗,精密度指的是隨機誤差的大小,每次精密度實驗都相當于1次抽樣,抽樣結(jié)果是不恒定的;而不確定度是指真值所涵蓋的某一概率(一般是66.7%或95%)區(qū)間,與分析儀器、方法及條件有關,在重復性條件下,同一方法不同