電針足三里三陰交穴改善脾虛證大鼠能量代謝作用機(jī)制的研究

電針足三里三陰交穴改善脾虛證大鼠能量代謝作用機(jī)制的研究

實(shí)驗(yàn)中選擇了美國軍官的干凈雄性大鼠。它的雄性為180.200g，三個(gè)月內(nèi)有48例。由陸軍軍事學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（軍隊(duì)）提供。隨機(jī)數(shù)字表分為4組，每組12只。造模方法采用飲食不節(jié)和過度勞倦塑造脾虛模型:第1~7天自由飲食飲水,每日觀察并記錄大鼠食量水量。第7天稱重。第8~32天單日喂食甘藍(lán)15~20g/只,自由飲水;游泳至耐力極限(指大鼠游泳至口鼻部首次浸入水中),每只雙日喂飼豬油脂1.5mL/100g。第32天按下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估:(1)體重的減輕,消瘦;(2)肛溫?zé)o明顯變化或降低;(3)糞便時(shí)軟、時(shí)溏(拉尾排便次數(shù)的增多,便形溏稀,肛周污穢);(4)食量的減少;(5)游泳耐力的下降;(6)倦怠,懶動(dòng),蜷縮聚堆,瞇眼,弓背。評(píng)估大白鼠脾氣虛證的主要依據(jù)有4個(gè)方面的文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn):(1)大白鼠的生物學(xué)特征;(2)衛(wèi)生部藥政司《關(guān)于中藥治療脾虛證的臨床研究指導(dǎo)原則》中的診斷標(biāo)準(zhǔn);(3)在全國具有一定影響力的專著:《實(shí)用中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)》(李德新,1985),《21世紀(jì)課程教材-中醫(yī)基礎(chǔ)理論》(李德新,2001),《實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué)》(陳小野,1993);(4)1986年全國中西醫(yī)結(jié)合老年病防治學(xué)術(shù)會(huì)議確定的“中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)”。造模成功后空白對(duì)照組繼續(xù)給予自由飲食飲水;模型對(duì)照組繼續(xù)施加造模因素,其余各組停止施加造模因素;針刺治療組和中藥治療組進(jìn)行以下干預(yù)。針刺治療組:捆綁束縛后針刺治療組電針“足三里”穴、“三陰交”穴各20min,每天同一時(shí)間,連續(xù)15d。模型對(duì)照組及空白對(duì)照組捆綁束縛20min不針刺。電針參數(shù):疏密波,頻率2Hz,強(qiáng)度2V。足三里取穴:大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5mm(參照林文注《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》,上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1994)?！叭幗弧比⊙?大鼠內(nèi)踝尖直上約5mm,脛骨內(nèi)側(cè)緣(參照林文注《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》,上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1994)。取穴方法選用皮膚電阻測定法。中藥治療組:將配制好的中藥四君子湯:人參10g、白術(shù)9g、茯苓9g、炙甘草6g(購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥局)正常煎煮2次,煎劑放入70℃恒溫水浴鍋蒸發(fā)濃縮,藥液濃縮成每毫升相當(dāng)于1g生藥濃度。依據(jù)等效劑量直接計(jì)算法,將成人臨床用量,換算大鼠用量。相當(dāng)于每日1.2mL/100g。每日按照上述劑量對(duì)中藥治療組大鼠進(jìn)行灌胃,每日1次。模型對(duì)照組采用生理鹽水每日1.2mL/100g,胃飼。實(shí)驗(yàn)第47天對(duì)4組大鼠進(jìn)行體重、肛溫、游泳耐力、食量、水量的測定。然后采用腹主動(dòng)脈取血法進(jìn)行標(biāo)本制備。用10%水合氯醛按0.3mL/100g腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠。大鼠麻醉后,仰臥固定于大鼠手術(shù)臺(tái)上。常規(guī)消毒后用手術(shù)剪沿腹正中線剪開腹腔。充分暴露腹主動(dòng)脈。術(shù)者右手持注射器,針尖方向朝上,入針角度約25°~30°,朝向心端方向刺入,與血管保持平行,深度約5mm左右。取血2mL(摘去注射器針頭),沿試管壁緩慢注入事先加好抑肽酶40μL,EDTA-Na230μL的試管中,輕輕振蕩混勻,然后快速4℃離心(3500r/min)10min,取上清,于-20℃低溫冰箱保存待測。大鼠內(nèi)皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)含量檢測方法按試劑盒說明書進(jìn)行操作。以上所有數(shù)據(jù)用x—±s表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件17.0版本進(jìn)行處理。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析;組間均數(shù)兩兩比較采用ANOVA中的LSD多重比較方法。2.1一般資料檢測,云病情報(bào)應(yīng)與中藥治療大鼠體重、飲水量、第三人體重增的比較見表1實(shí)驗(yàn)第47天,測定各組大鼠體重、肛溫、游泳耐力、食量、飲水量,并觀察其它狀態(tài)。具體方法如前所述。見表1~2。由表1、2可以看出,治療后,模型對(duì)照組、中藥治療組和針刺治療組的體重、游泳耐力仍低于正常組(P<0.01),但針刺組和中藥治療組的體重、游泳耐力,已明顯增加,與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。飲食量及進(jìn)水量與模型組相比均有顯著差異,肛溫變化不明顯。結(jié)果提示:本次實(shí)驗(yàn)中,體重、游泳耐力的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脾氣虛證造模方法使其相應(yīng)模型對(duì)照組大鼠體重出現(xiàn)相應(yīng)減輕。四君子湯治療后能使其相應(yīng)大鼠體重增加;針刺對(duì)于模型大鼠體重的增加作用與中藥治療組相同,可以接近正常水平。而食量和飲水量的變化由于計(jì)算的是平均值,并沒有做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,但是從表中可以看出中藥治療組和針刺治療組與模型對(duì)照組有一定差異。實(shí)驗(yàn)過程中,模型對(duì)照組大白鼠形體消瘦、弓背、瞇眼、倦怠、懶動(dòng)、蜷縮,排便增多,糞便時(shí)干時(shí)軟,肛周污穢?？瞻讓?duì)照組大鼠體重適中,活動(dòng)自如,反應(yīng)靈敏,皮毛光澤,大便未見異常。中藥治療組、針刺治療組大鼠狀態(tài)與空白對(duì)照組治療后均有所好轉(zhuǎn)。針灸治療組、中藥治療組大白鼠體征及其它狀態(tài)等與模型對(duì)照組相比,均有一定程度的改善。雖然有些指標(biāo)并未恢復(fù)到正常值水平,但是可以確定的是針灸和中藥具有非常顯著的治療效果,且效果相同。2.2針刺治療組和空白對(duì)照組輸注后cci比較見表3。上述數(shù)據(jù)顯示:模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,血清中ET-1含量顯著升高(P<0.01),針刺治療組血清中ET-1含量明顯低于模型對(duì)照組(P<0.01),但從圖1看出,針刺治療組仍高于空白對(duì)照組(P<0.05),而針刺治療組與中藥治療組相比,無顯著差異(P>0.05)。見表4,圖2。上述數(shù)據(jù)顯示:模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,血清NO顯著降低(P<0.01),針刺治療組血清NO明顯高于模型對(duì)照組(P<0.01),而針刺治療組與中藥治療組相比無顯著差異(P>0.05)。3中藥結(jié)合模型脾氣虛證一直是近年研究的熱點(diǎn),現(xiàn)代醫(yī)家通過大量的臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)學(xué)的脾虛證涵蓋了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多系統(tǒng)的疾病。朱兆洪等以大黃灌胃造成小鼠脾虛模型,同時(shí)針刺“足三里”穴來觀察對(duì)一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影響。結(jié)果表明,針刺“足三里”能夠降低脾虛動(dòng)物腦組織中NO含量及NOS的活性,提高紅細(xì)胞SOD活性和腎組織中總抗氧化能力(T-AO),減少心肌組織丙二醛(MDA)的生成。并認(rèn)為針刺“足三里”能夠改善脾虛動(dòng)物機(jī)體內(nèi)自由基代謝。吳兆利等采用中醫(yī)脾虛動(dòng)物模型和西醫(yī)哮喘動(dòng)物模型的復(fù)合造模方法,建立大鼠脾虛哮喘病證結(jié)合模型,采取針刺“足三里”的方法進(jìn)行治療。通過采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(EL1SA)檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TGF-p、GM-CSF的濃度。結(jié)論顯示脾虛加重氣道炎癥反應(yīng)是通過影響炎癥細(xì)胞凋亡調(diào)控因子的濃度來實(shí)現(xiàn)的。針刺“足三里”具有促進(jìn)模型大鼠BALF中低水平TGF-p濃度的增高、抑制GM-CSF濃度增高的作用。本實(shí)驗(yàn)通過飲食不節(jié)和過度勞倦塑造脾虛模型,雙日胃飼豬油脂屬肥甘厚味,單日限量喂食甘藍(lán)并游泳至體力極限,飲食勞倦則傷脾,導(dǎo)致動(dòng)物脾氣虛弱而致脾失健運(yùn),運(yùn)化不足,水谷精微不能運(yùn)化而變?yōu)橹瑵?至全身聚而生痰,而致血流緩慢血液黏度大,極易導(dǎo)致臨床上常見的高血壓、高血脂及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。這也為日后做深層次的研究做鋪墊。血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)變化可引起血管壁的增厚、管腔狹窄、血管順應(yīng)性的降低以及血管重構(gòu),在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、高血脂等血管平滑肌增殖性疾病的發(fā)生與發(fā)展有中其重要作用。血管平滑肌細(xì)胞對(duì)不同血管活性物質(zhì)刺激可以呈現(xiàn)不同的敏感性。本實(shí)驗(yàn)中,脾氣虛大鼠模型血清中ET的含量較對(duì)照組顯著增高,而NO含量降低,二者之間的平衡被打破,勢必會(huì)引起血管平滑肌的異常收縮或其他的病理改變,而中藥治療組和針刺治療組能夠降低大鼠血清中ET的含量,提高NO的含量,同時(shí)降低血管平滑肌的張力、降低外周阻力而達(dá)到抑制血管重塑進(jìn)程的目的,并以此改善脾氣虛證大白鼠的癥狀