高產(chǎn)香乳酸菌菌株的選育

高產(chǎn)香乳酸菌菌株的選育HJ14mm]收稿日期：2016-06-20基金項(xiàng)目：安陽(yáng)工學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)和人民生活水平的提高，人們對(duì)酸奶營(yíng)養(yǎng)成分的關(guān)注意識(shí)逐步增強(qiáng)，對(duì)酸奶的外觀特性（風(fēng)味、口感、品質(zhì)）也是越來(lái)越重視。但是酸奶具有良好的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，這無(wú)疑使其在快節(jié)奏的生活中占據(jù)了越來(lái)越重要的地位。各種各樣的添加劑賦予了酸奶良好的風(fēng)味，但是人們更為擔(dān)心的是這些添加劑會(huì)給人帶來(lái)的負(fù)面影響，于是對(duì)乳酸菌的品質(zhì)提出了更高要求。菌株的發(fā)酵性能直接影響到酸奶的發(fā)酵質(zhì)量，對(duì)酸奶的產(chǎn)香也有很大的影響。應(yīng)用于乳制品加工的發(fā)酵微生物主要是乳酸菌，構(gòu)成牛乳主體香味的物質(zhì)主要是雙乙酰、乙醛、二甲硫醇、脂肪酸、酮類、內(nèi)酯等。其中，？0櫓破廢閹鍍鸕街饕?調(diào)節(jié)作用的是雙乙酰和乙醛。嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌分別為雙乙酰和乙醛的主要產(chǎn)生菌種1-2]。本研究選取從市售酸奶中分離篩選出的產(chǎn)香性能較好的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變，篩選出高產(chǎn)香菌株，并將其應(yīng)用于酸奶發(fā)酵中，提高酸奶的品質(zhì)。1材料與方法11材料與試劑菌株：從市售花花牛酸奶中分離得到保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。主要試劑：脫脂乳粉，食品級(jí)，內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)XX公司；花花牛酸奶，食品級(jí)，河南花花牛乳業(yè)XX公司；葡萄糖，分析純，天津北辰方正試劑廠；吐溫80、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸氫二鉀、硫代硫酸鈉，分析純，天津市北方化玻購(gòu)銷中心；乙酸鈉，分析純，北京北化化學(xué)品有限責(zé)任公司；硫酸鎂，分析純，北京57601化工廠；硫酸錳，分析純，河南焦作市化工三廠；鄰苯二胺，分析純，三遠(yuǎn)化工XX公司。12儀器與設(shè)備DZKW-S電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造XX公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;XSP-1C電子顯微鏡，浙江寧波市鎮(zhèn)海中華電子儀表廠；ZXGP-A2160電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造XX公司；TU-1810DASPC分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器XX公司；22331超高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；SW-CJ-2FD垂直流雙人單面超凈工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造XX公司；CBIO-UV8C紫外線誘變箱，北京賽百奧科技XX公司。13試驗(yàn)方法該試驗(yàn)的具體技術(shù)路線如下：從酸奶中分離出保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌3-5］，從中選出產(chǎn)雙乙酰和乙醛較好的菌株，經(jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)富集菌體，再離心獲得菌體6］，通過(guò)不同條件的紫外線誘變7-14］得到誘變菌株，并對(duì)其產(chǎn)香性能進(jìn)行測(cè)定15-20］，選出優(yōu)良產(chǎn)香菌株。131主要培養(yǎng)基1311脫脂乳培養(yǎng)基配制方法按1g：10mL的比例將適量的脫脂乳粉加蒸餾水溶解，密封置于滅菌鍋中115°C蒸汽滅菌10?15min，經(jīng)高壓滅菌后置于冰箱中備用。1312MRS培養(yǎng)基固體MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g,酵母浸膏5g，牛肉膏10g，瓊脂20g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g,葡萄糖20g，吐溫801mL，硫酸鎂058g，硫酸錳025g，蒸餾水1L，121C高壓滅菌20min。液體MRS培養(yǎng)基的配制參照固體培養(yǎng)基，將上述固體MRS培養(yǎng)基中的瓊脂去掉。1313M17培養(yǎng)基固體M17培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏5g，硫酸鎂0258，廿油10g，乳糖3g，磷酸氫二鉀5g，瓊脂20g，蒸餾水1L。液體M17培養(yǎng)基只需將上述固體M17培養(yǎng)基中的瓊脂去掉。132菌種分離將菌種稀釋成不同稀釋梯度的菌懸液。用移液槍分別吸取10-4、10-5、10-63個(gè)試管中的菌懸液01mL滴在MRS、M172種固體培養(yǎng)基表面中央位置，用無(wú)菌玻璃涂布棒將菌液均勻涂開(kāi)，靜置數(shù)分鐘，使菌液浸入培養(yǎng)基。將平板倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱中37C培養(yǎng)2d。133保加利亞乳桿菌的誘變前準(zhǔn)備用上步中得到的保加利亞乳桿菌菌株制作發(fā)酵劑，并活化3代，以2%接種量將菌種接入滅菌脫脂乳中，37°C培養(yǎng)16h20],通過(guò)檢測(cè)脫脂乳的酸度、產(chǎn)乙醛的量，確定產(chǎn)香性能好的菌株作為出發(fā)菌株。將純化的出發(fā)保加利亞乳桿菌菌種接種至配制的MRS液體培養(yǎng)基。37C培養(yǎng)24h后每隔4h取出2個(gè)試管作為平行組，滴定檢測(cè)其酸度，繪制保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)曲線。根據(jù)上述繪制的生長(zhǎng)曲線，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)之后的保加利亞乳桿菌培養(yǎng)液，在4C下4000rmin離心20min,棄去上清液，用無(wú)菌水洗滌菌體，收集菌體并倒入平板，為誘變做準(zhǔn)備。 134保加利亞乳桿菌的紫外誘變將倒入平板的菌液于垂直距離紫外燈20cm處下開(kāi)蓋照射120s，紫外線波長(zhǎng)分別為254、365nm。將倒入平板的菌液在波長(zhǎng)為365nm的情況下，豎直距離紫外燈15、20cm處照射120s誘變。將倒入平板的菌液于波長(zhǎng)為365nm，距離紫外燈20cm處，分別照射60、120、180s。將未經(jīng)照射的和經(jīng)過(guò)紫外照射的菌液分別計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。致死率二(未照射菌數(shù)-照射后菌數(shù))未照射菌數(shù)]X100%。從致死率90%左右的平板中，挑選5個(gè)單菌落，接種至脫脂乳中培養(yǎng)至凝乳，測(cè)定產(chǎn)乙醛性能。135嗜熱鏈球菌的產(chǎn)香性能測(cè)定將分離純化得到的嗜熱鏈球菌疑似菌株，活化3代后，接種至脫脂乳，42°C培養(yǎng)14h后1],檢測(cè)產(chǎn)雙乙酰的量，確定產(chǎn)雙乙酰量最多的作為出發(fā)菌株。136嗜熱鏈球菌的誘變前準(zhǔn)備及誘變嗜熱鏈球菌的誘變前準(zhǔn)備方法與保加利亞乳桿菌相同，只是將MRS培養(yǎng)基改為M17培養(yǎng)基。嗜熱鏈球菌接下來(lái)的操作參照保加利亞乳桿菌的處理。14評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定方法保加利亞乳桿菌乙醛產(chǎn)量的檢測(cè)參照劉鵬等的檢測(cè)方法20]。嗜熱鏈球菌雙乙酰產(chǎn)量的檢測(cè)參照王丹等的檢測(cè)方法17]。用吉爾涅爾度（°T）來(lái)表示滴定酸度。采用MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基測(cè)定酸奶中乳酸菌總菌數(shù)。吸光度的測(cè)量采用分光光度計(jì)，波長(zhǎng)335nm。2結(jié)果與分析21菌種分離通過(guò)菌種分離，得到了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。分離效果見(jiàn)圖1、圖2。FK（W12]TPDL1tif]22保加利亞乳桿菌的誘變與檢測(cè)221保加利亞乳桿菌產(chǎn)香菌株的初步篩選從純化后的平板上取10個(gè)疑似目標(biāo)菌落，活化3代以后，分別接種至脫脂乳培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)16h，檢測(cè)其產(chǎn)乙醛的情況（表1）。從表1可以看出，2號(hào)菌株的產(chǎn)乙醛量明顯優(yōu)于其他菌株，為（1265±017）MgmL，確定2號(hào)菌株為出發(fā)菌株。222保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)曲線的繪制保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，單個(gè)菌種的生長(zhǎng)曲線都呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢(shì)，并且2個(gè)菌種都是在32h左右滴定酸度的變化不再明顯，可以確定32h為菌種繁殖量最大的時(shí)間點(diǎn)。選取32h作為制備菌懸液的最佳時(shí)間。223保加利亞乳桿菌的紫外誘變按照前述的誘變方法，保加利亞乳桿菌的誘變結(jié)果見(jiàn)表2。隨著紫外波長(zhǎng)的增大，致死率逐漸增大，因此選擇致死率最大的365nm為最佳誘變劑量；垂直誘變距離為15cm時(shí)的致死率相對(duì)較高，為935%，因此選擇15cm為最佳誘變劑量；誘變時(shí)間為120s時(shí)致死率相對(duì)較高，為984%，而且菌株生長(zhǎng)更好，因此選擇120s為最佳誘變劑量。綜上所述，保加利亞乳桿菌的最佳誘變參數(shù)為紫外波長(zhǎng)365nm、垂直?T變距離15cm、誘變時(shí)間120s。224誘變之后保加利亞乳桿菌的產(chǎn)香檢測(cè)從誘變后篩選出的高死亡率的平板中分別挑出5個(gè)保加利亞乳桿菌菌株，接種至脫脂乳中活化3代，然后按2%的劑量接種到脫脂乳培養(yǎng)基，37°C下培養(yǎng)16h，菌株的產(chǎn)香情況見(jiàn)表3。從表3可以看出，誘變波長(zhǎng)為365nm時(shí)，菌株的產(chǎn)乙醛量有升高也有降低，其中L-21、L-24的產(chǎn)乙醛量較出發(fā)菌株均下降；菌株L-22的產(chǎn)乙醛量相對(duì)較高，為最佳菌株。誘變距離為15cm時(shí)，保加利亞乳桿菌的產(chǎn)乙醛量均有上升，其中菌株L-2a的產(chǎn)乙醛量最高，確定為最佳菌株。誘變時(shí)間為120s時(shí)，保加利亞乳桿菌的產(chǎn)乙醛量有升高也有降低，其中菌株L-2D的產(chǎn)乙醛量最高，菌株L-2C的產(chǎn)乙醛量下降，確定L-2D為最佳菌株。23嗜熱鏈球菌的誘變與檢測(cè)231嗜熱鏈球菌產(chǎn)香菌株的初步篩選從純化的平板上挑取10個(gè)嗜熱鏈球菌疑似菌株，活化3代后，按2%的接種量接種至脫脂乳中42°C培養(yǎng)14h，檢測(cè)其產(chǎn)雙乙酰的情況(表4)。從表4可以看出，1號(hào)菌株的產(chǎn)雙乙酰量相對(duì)較高，為(296±016)MgmL，因此確定ST為出發(fā)菌株。232嗜熱鏈球菌的紫外誘變參照保加利亞乳桿菌的紫外誘變方法，嗜熱鏈球菌的誘變情況見(jiàn)表5。從表5可以看出，紫外波長(zhǎng)為365nm的時(shí)候，菌株的致死率相對(duì)較高，為955%，因此確定波長(zhǎng)365nm為最佳誘變劑CM(25］量。當(dāng)垂直照射距離為15cm時(shí)，紫外誘變的致死率相對(duì)較高，為953%，因此選取垂直照射距離15cm為最佳誘變劑量。誘變時(shí)間為120s時(shí)，紫外誘變致死率高，為961%，因?yàn)檫x取120s為最佳誘變劑量。綜上所述，嗜熱鏈球菌的最佳誘變參數(shù)為紫外波長(zhǎng)365nm、垂直照射距離15cm、誘變時(shí)間120s。233誘變之后嗜熱鏈球菌的產(chǎn)香檢測(cè)從誘變后致死率高的平板中分別挑出5個(gè)疑似嗜熱鏈球菌菌株，接種至脫脂乳中活化3代，然后按2%的劑量接種到脫脂乳培養(yǎng)基，42°C下培養(yǎng)14h,菌株的產(chǎn)香情況見(jiàn)表6。從表6可以看出，紫外誘變波長(zhǎng)為365nm時(shí)，各個(gè)菌株的產(chǎn)雙乙酰量均有所增加，其中S-14的產(chǎn)雙乙酰量最高，所以選取S-14作為最佳菌株。垂直照射距離為15cm時(shí)，各個(gè)菌株的產(chǎn)雙乙酰量均有所增加，其中菌株S-1d的產(chǎn)雙乙酰量明顯最高，所以選取S-1d為最佳菌株。誘變時(shí)間為120s時(shí)，各個(gè)菌株的產(chǎn)雙乙酰量均有所下降，特別是S-1C菌株，產(chǎn)雙乙酰量最少。3結(jié)論(1)從市售花花牛酸奶中通過(guò)菌種分離和產(chǎn)香檢測(cè)，篩選出高產(chǎn)乙醛的L-2菌株和高產(chǎn)雙乙酰的S-1菌株作為出發(fā)菌株，其中L-2的產(chǎn)乙醛量為1265pgmL，S-1的產(chǎn)雙乙酰量為296pgmL。通過(guò)確定最佳誘變參數(shù)(紫外照射波長(zhǎng)365nm、垂直照射距離15cm、紫外照射時(shí)間120s)，篩選出了保加利亞乳桿菌L-22、L-2a、L-2D為3個(gè)誘變情況下產(chǎn)乙醛量最高的菌株，產(chǎn)量分別為1351、1652、1446pgmL，相比出發(fā)菌株L-2，分別增加了68%、306%、143%。與保加利亞乳桿菌同樣的誘變劑量，篩選出了嗜熱鏈球菌S-14、S-1d的產(chǎn)雙乙酰量分別為336、416pgmL，較出發(fā)菌株分別增加了135%、405%。在產(chǎn)量