臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn) 緒論

臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)姜威Contents臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用存在的問題以及標(biāo)準(zhǔn)化123臨床分子生物學(xué)發(fā)展方向41.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床醫(yī)學(xué)的主要任務(wù)是什么？研究疾病的病因、診斷、治療和預(yù)后，提高臨床治療水平，促進(jìn)人體健康臨床檢驗(yàn)的主要任務(wù)1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床檢驗(yàn)臨床微生物檢驗(yàn)臨床免疫檢驗(yàn)臨床生化檢驗(yàn)臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)臨床血液學(xué)檢驗(yàn)1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展望問聞切1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展公元前300年，希波克拉底提倡尿液檢查診斷疾病。1500年，內(nèi)科醫(yī)生開始使用尿液顏色比對圖進(jìn)行直觀尿液分析。1590年，hasjanssen發(fā)明了復(fù)式顯微鏡。1592年，伽利略發(fā)明了溫度計。1684年，安東·范·列文虎克出版了第一本細(xì)菌繪圖。

臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的定義？臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)（clinicalmolecularbiology）是利用分子生物學(xué)理論與技術(shù)從基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等水平研究疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、疾病的預(yù)測與風(fēng)險評價、疾病的臨床診斷與治療，以及疾病的預(yù)防與控制.1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展第一代檢驗(yàn)診斷早期細(xì)胞形態(tài)雪檢驗(yàn)第二代檢驗(yàn)診斷20世紀(jì)50年代生化檢驗(yàn)第三代檢驗(yàn)診斷20世界60年代免疫學(xué)檢驗(yàn)第四代檢驗(yàn)診斷基因（分子生物學(xué)）檢驗(yàn)診斷以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)非特異滯后難以早期診斷以疾病基因?yàn)樘綔y對象特異性強(qiáng)、敏感可以早期診斷臨床檢驗(yàn)的發(fā)展第四代檢驗(yàn)診斷第三代檢驗(yàn)診斷1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋模型，現(xiàn)代分子生物學(xué)開始興起，為分子檢驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)JamesWatson和FrancisCrick1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展：DNA雜交技術(shù)1976年，美籍華裔科學(xué)家簡悅威（YuetWaiKan）首次利用液相DNA分子雜交技術(shù)，進(jìn)行了α地中海貧血的產(chǎn)前診斷簡悅威，漢族，醫(yī)學(xué)家。美國國籍。國際醫(yī)學(xué)界知名的遺傳學(xué)和“脫氧核糖核酸”（DNA）專家。第一階段核心技術(shù)：分子雜交技術(shù)以基因突變位點(diǎn)(導(dǎo)致單基因疾?。榘袠?biāo)1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:PCR技術(shù)的發(fā)明1985年，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的創(chuàng)建，使大量獲得靶DNA片段成為可能,大大提高檢測的特異性和靈敏性穆利斯(K.B.Mullis)PCR技術(shù)的發(fā)明者1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:PCR技術(shù)的發(fā)明PCR儀瓊脂糖凝膠電泳儀1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:PCR技術(shù)的發(fā)明熒光PCR儀凝膠成像系統(tǒng)臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:PCR技術(shù)的發(fā)明以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，產(chǎn)生的衍生技術(shù)：PCR-限制性酶切片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）等位基因特異性PCRPCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（PCR-SSCP）實(shí)時定量熒光PCR(QuantitativeReal-time

PCR)第二階段核心技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)以基因組特異性序列（DNA,RNA）為靶標(biāo)為獲得性（病原微生物）基因疾?。―NA,RNA）的診斷提供了有效的方法。1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:PCR技術(shù)的發(fā)明1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展PCR電泳結(jié)果Q-PCR結(jié)果1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:以生物芯片為代表的高通量密集型技術(shù)最早的微陣列圖片生物芯片：一般指高密度固定在互相支持介質(zhì)上的生物信息分子（如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白質(zhì)、糖分子、組織等）的微陣列雜交型芯片。1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:以生物芯片為代表的高通量密集型技術(shù)1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:以生物芯片為代表的高通量密集型技術(shù)基因芯片基因芯片熱圖第三階段核心技術(shù)：生物芯片（biochip）高通量技術(shù)以基因組特異性核酸序列（DNA,RNA），蛋白質(zhì)分子為靶標(biāo)為復(fù)雜性（多因素，多基因）疾病提供了有效的分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:DNA測序技術(shù)測序峰圖sanger第四階段核心技術(shù)：DNA測序技術(shù)（蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)）以基因組特異性核酸序列，蛋白質(zhì)分子，代謝物為靶標(biāo)特點(diǎn)：高靈敏度，高特異性，高通量，高自動化1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:DNA測序技術(shù)核酸測序技術(shù)為臨床疾病扥分子診斷提供最精確的判定依據(jù)，是分子生物學(xué)檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)測序方法：第一代：雙脫氧末端終止法第二代：焦磷酸測序法第三代：單分子實(shí)時測序，大大降低成本，有望實(shí)現(xiàn)1000USD對人類基因組進(jìn)行測序1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:蛋白技術(shù)蛋白芯片技術(shù)1.臨床分子生物學(xué)定義及其發(fā)展臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展:蛋白技術(shù)檢測到陽性胃癌蛋白指紋2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)的靶標(biāo)狹義的講，目前分子生物學(xué)檢驗(yàn)的靶標(biāo)主要以核酸為主廣義上講，臨床分子檢驗(yàn)的生物標(biāo)志物包含基因組DNA,各種RNA，蛋白質(zhì)以及代謝物。2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用單基因?。系聽栠z傳性疾?。╃牭稜罴t細(xì)胞貧血癥的檢測一種常染色體退化遺傳病引起原因：珠蛋白的β基因發(fā)生了一個點(diǎn)突變

β基因的第6位密碼子為GAG,編碼谷氨酸,突變后為GTG,編碼纈氨酸。檢測方法：該突變導(dǎo)致該基因丟失了一個可被MstII切開的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。單基因?。系聽栠z傳性疾?。?.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用脆性X染色體綜合征脆性X染色體綜合征導(dǎo)致患者智障（Martin-Bell綜合征），脆性X綜合癥是由于在人體內(nèi)X染色體的形成過程中的突變所導(dǎo)致。已發(fā)現(xiàn)了致病基因FMR-1，它含有（CGG）n三核甘酸重復(fù)序列，后者在正常人約為30拷貝，而在正常男性傳遞者和女性攜帶者增多到150~500bp，稱為小插入，相鄰的Cpg

島未被甲基化，這種前突變（premutation

）無或只有輕微癥狀?，F(xiàn)已可用RFLP連鎖分析、DNA雜交分析、PCR擴(kuò)增等方法檢測成年型多囊腎病單基因?。系聽栠z傳性疾?。?.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用成年型多囊腎病是一種常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率高，約1000人中有1名致病基因的攜帶者，起病較晚，多在30歲以后，主要為腎和肝中出現(xiàn)多發(fā)性囊腫由于通過家系分析，已證實(shí)APKD的致病基因與α珠蛋白基因3’端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列即3’HVR(3’hypervariableregion)緊密連鎖，而后者在人群中具有高度多態(tài)性，因此可以通過RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷。2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用感染性基因病乙型肝炎病毒的分子生物學(xué)檢驗(yàn)乙型肝炎病毒核酸的檢驗(yàn)HBVDNA是病毒復(fù)制和傳染性的直接標(biāo)志。定量檢測HBVDNA對于判斷病毒復(fù)制程度、傳染性大小、抗病毒藥物療效等有重要意義。PCR引物常根據(jù)其S、C、P和X基因中的高度保守序列來設(shè)計熒光定量PCR技術(shù)能準(zhǔn)確地反映HBVDNA的復(fù)制水平、病程變化和治療恢復(fù)情況等，特異性高。

支鏈DNA技術(shù)，核酸雜交技術(shù)等。

丙型肝炎病毒的分子生物學(xué)檢驗(yàn)2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用感染性基因病丙型肝炎病毒的核酸檢測肝組織內(nèi)HCVRNA檢測可應(yīng)用斑點(diǎn)核酸雜交技術(shù)，血清中HCVRNA檢測多采用PCR、核酸雜交、bDNA、基因芯片、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng)等技術(shù)。5′UTR區(qū)的序列最保守，種系變化程度及進(jìn)化率很低，可用于區(qū)分主要基因型2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用感染性基因病埃博拉病毒的分子生物學(xué)檢測2014年埃博拉病毒感染在西非引起高致死性出血熱疫情流行，目前對該病毒缺乏特異性的疫苗和治療方案，早期快速診斷能明顯降低感染死亡率。EBOV引物設(shè)計必須兼顧各亞型的敏感性，避免其他類似出血熱病毒干擾，目前一般選擇EBOV高度保守的GP或NP作為擴(kuò)增的靶標(biāo)設(shè)計引物和探針，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時定量熒光PCR相結(jié)合的方法來進(jìn)行檢測。結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用感染性基因病結(jié)核分枝桿菌可通過呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入易感機(jī)體，引起多種組織器官的結(jié)核病，其中以通過呼吸道引起肺結(jié)核為最多。PCR擴(kuò)增所選靶序列主要有65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TBIS6110插入序列、染色體DNA的重復(fù)序列等。PCR-RFLP，real-timePCR，等技術(shù)均可

2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用感染性基因病2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用禽流感的亞型目的基因錯重PCR擴(kuò)增2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用復(fù)雜性疾病（多基因，多因素）高血壓的分子生物學(xué)診斷目前關(guān)于原發(fā)高血壓相關(guān)的易感基因的研究現(xiàn)狀：1號染色體位于1p36.1的ECE1基因以及1q42-q43的AGT基因是人類血壓調(diào)節(jié)的候選基因。2號染色體2p25-p24是原發(fā)高血壓的易感位點(diǎn)。3號染色體位于3q21-q25的AGTR1A基因以及3p14.1-q12.3是與原發(fā)高血壓相關(guān)。4號染色體位于4p16.3的ADD1基因與鹽敏感性原發(fā)性高血壓相關(guān)。7號染色體位于7q22.1的CYP3A5基因與鹽敏感性原發(fā)性高血壓相關(guān)；位于7q36的NOS3基因與妊娠高血壓相關(guān)。11號染色體研究提示位于11q的數(shù)量性狀遺傳位點(diǎn)與血壓的調(diào)節(jié)相等。2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用復(fù)雜性疾?。ǘ嗷?，多因素）腫瘤的基因診斷腫瘤基因診斷的常用方法PCR、RT-PCR，Southernblot雜交技術(shù)、Northernblot雜交技術(shù)，基因芯片，基因測序等。胃癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌等，在p53,ERras等基因上會有點(diǎn)突變。結(jié)腸癌、腎癌、乳腺癌、腦瘤等CD44，muc-1,VLA-4等基因的拼接會產(chǎn)生改變。組織特異性基因標(biāo)志物2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用復(fù)雜性疾病（多基因，多因素）存在于腫瘤及其起源的正常細(xì)胞中，不存在于其他細(xì)胞。如CEAmRNA、AFPmRNA、PSAmRNA等血管生成因子,如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）等。腫瘤基因診斷的常用方法PCR、RT-PCRSouthernblot雜交技術(shù)、Northernblot雜交技術(shù)基因芯片基因測序。2.臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容及其應(yīng)用耐藥性分析結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測耐利福平分子機(jī)制：是由于其作用靶標(biāo)—結(jié)核桿菌DNA依賴RNA聚合酶β亞