微生物檢驗(yàn)(李魯平)

臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)沈陽(yáng)市第六人民醫(yī)院李魯平電話：23393138E-mail：luping4758@163.com10/4/20231臨床標(biāo)本的采集與處理細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查細(xì)菌的分離培養(yǎng)與接種技術(shù)細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定的理論基礎(chǔ)醫(yī)院感染的實(shí)驗(yàn)診斷抗菌藥物敏感性試驗(yàn)10/4/20232一、微生物檢查基本方法10/4/20233致病菌的檢驗(yàn)程序標(biāo)本直接涂片染色鏡檢分離培養(yǎng)與鑒定病原菌抗原檢測(cè)其它檢測(cè)形態(tài)、結(jié)構(gòu)、染色性涂片鏡檢菌落特征生化反應(yīng)藥敏試驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)沉淀反應(yīng)協(xié)同凝集免疫熒光對(duì)流免疫電泳酶免疫測(cè)定免疫印跡細(xì)菌代謝產(chǎn)物（氣相色譜）細(xì)菌核酸（PCR）噬菌體分離細(xì)菌素測(cè)定分子生物學(xué)技術(shù)動(dòng)物試驗(yàn)10/4/20234一、微生物檢查基本方法與診斷技術(shù)

(一)

細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查法:1.顯微鏡檢查法:①普通光學(xué)顯微鏡：②

暗視野顯微鏡：③

相差顯微鏡：④

熒光顯微鏡：⑤

電子顯微鏡：2.細(xì)菌標(biāo)本染色法;①單染色法:用一種染料將細(xì)菌和周圍物體染成同一種染色。②復(fù)染色法:用兩種或兩種以上染料染色的方法革蘭染色；抗酸染色；10/4/20235(二)

細(xì)菌的人工培養(yǎng)及生化實(shí)驗(yàn)1.細(xì)菌的人工培養(yǎng)法

①培養(yǎng)基:根據(jù)用途分基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、特殊培養(yǎng)基。根據(jù)物理性狀分液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。②

細(xì)菌接種法:③細(xì)菌培養(yǎng)法:需氧培養(yǎng);厭氧培養(yǎng);二氧化碳培養(yǎng);微需氧培養(yǎng)。10/4/202362.細(xì)菌生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、種類及原理

①

糖分解產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn);葡萄糖代謝類型鑒別試驗(yàn);七葉苷水解試驗(yàn);淀粉水解實(shí)驗(yàn);甲基紅試驗(yàn);V-P試驗(yàn);ONPG試驗(yàn).

②

蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物試驗(yàn)明膠液化試驗(yàn);吲哚試驗(yàn);硫化氫試驗(yàn);尿素酶試驗(yàn);苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn);氨基酸脫羧酶試驗(yàn).③碳源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn),丙二酸鹽利用試驗(yàn).④呼吸酶類試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn);觸酶試驗(yàn);硝酸鹽還原試驗(yàn).⑤其他生化試驗(yàn)脂酶試驗(yàn);磷酸酶試驗(yàn);DNA試驗(yàn);凝固酶實(shí)驗(yàn)；膽汁溶菌試驗(yàn)10/4/20237細(xì)菌L型生長(zhǎng)緩慢，營(yíng)養(yǎng)要求高，對(duì)滲透壓敏感，普通營(yíng)養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，培養(yǎng)時(shí)必須用高滲的含血清的培養(yǎng)基。細(xì)菌L型在高滲的含血清的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后形成三種類型的菌落。

(三)

細(xì)菌L型的概念及檢查法10/4/20238二、微生物學(xué)檢驗(yàn)概述

(一)標(biāo)本采集種類與原則1)血液：一般在病人發(fā)熱初期或高峰期采集，懷疑細(xì)菌性心內(nèi)膜炎時(shí)，血培養(yǎng)不少于三次。一般為靜脈血，成人采血量10—20ml，嬰兒和兒童1—2ml。2)尿液：最好用導(dǎo)尿管收集尿液，要防止逆行性感染。3)糞便：取膿血或粘液的糞便置清潔容器中送檢。排便困難者，可用直腸拭子采樣。4)鼻咽拭子：5)痰：清晨第一口痰為宜，必須先用清水漱口，避免唾液混入。10/4/202396)腦脊液及其他：CSF應(yīng)無(wú)菌操作進(jìn)行腰椎穿刺；胸水、腹水、包液、滑囊液等用注射器無(wú)菌操作采集。7）眼,耳部標(biāo)本：用無(wú)菌拭子采集，及時(shí)接種相應(yīng)培養(yǎng)基。8)性傳播疾病標(biāo)本：男性采取尿道膿性分泌物，女性采取宮頸分泌物，供鏡檢及培養(yǎng)；梅毒取皮膚滲出物和淋巴穿刺液涂片；皰疹取皰內(nèi)液體或刺破小皰后，用無(wú)菌拭子采樣。9)創(chuàng)傷、組織、膿腫標(biāo)本：根據(jù)不同部位采取不同標(biāo)本。10/4/202310標(biāo)本運(yùn)送1）采集時(shí)間應(yīng)在疾病早期,急性期,癥狀典型或用藥之前采集標(biāo)本.2）根據(jù)不同目的采用不同的采集方法.3）除痰,大便,肛拭子等體外標(biāo)本,其他標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)用無(wú)菌操作,采集量不得過(guò)少.4）最好床邊接種.(保溫,冷藏,厭氧或種入運(yùn)送培養(yǎng)基內(nèi)).5)采集運(yùn)送時(shí)必須注意安全,防止污染及交叉感染.10/4/202311（二）微生物學(xué)檢查接到標(biāo)本后立即進(jìn)行微生物學(xué)檢查.1.

直接鏡檢：標(biāo)本經(jīng)涂片染色或制備濕片鏡檢。2.

快速診斷：快速檢測(cè)病原體成分主要是指特異性抗原和核酸檢測(cè).特異性抗原檢測(cè)包括免疫熒光技術(shù),膠乳凝集試驗(yàn),酶免疫技術(shù),對(duì)流免疫電泳,化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定等.

3.

直接藥敏試驗(yàn)：直接將標(biāo)本接種于平板，用抗生素紙片作藥物敏感試驗(yàn)，在18—24h內(nèi)可獲得結(jié)果。

4.

常規(guī)檢驗(yàn)：1)分離培養(yǎng)：通常由正常無(wú)菌部位采取的標(biāo)本接種血平板，置空氣或5%—10%二氧化碳的氣缸中培養(yǎng)，大部分細(xì)菌可于24—48h生長(zhǎng)良好。2)鑒定：分離出的細(xì)菌一般經(jīng)過(guò)細(xì)菌形態(tài),菌落特點(diǎn),生化反應(yīng),血清學(xué)試驗(yàn),動(dòng)物接種等鑒定。10/4/202312

3)體外純菌藥物敏感性試驗(yàn):包括抑菌試驗(yàn),殺菌試驗(yàn),聯(lián)合藥敏試驗(yàn)和檢測(cè)細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素滅活酶等。4)報(bào)告:直接鏡檢要求2小時(shí)報(bào)告,說(shuō)明標(biāo)本合格,發(fā)現(xiàn)微生物情況和特點(diǎn);初步鑒定和直接藥敏結(jié)果于24小時(shí)或次晨報(bào)告,報(bào)告可能的病原菌和直接藥敏結(jié)果;最后鑒定和細(xì)菌藥敏結(jié)果一般不超過(guò)3天。

5.血清學(xué)診斷:是指用已知抗原或已知抗體檢測(cè)患者血清中相應(yīng)抗體或抗原的方法。血清學(xué)凝集試驗(yàn)：采用含有已知特異性抗體的血清與分離培養(yǎng)出的未知純種細(xì)菌或標(biāo)本種的抗原進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng),以確定病原菌的種或型。10/4/202313臨床微生物實(shí)驗(yàn)室安全措施和質(zhì)量保證

1.

感染性廢棄物的處理1)去污染,任何污染材料未經(jīng)消毒不能拿出實(shí)驗(yàn)室.2)液體廢棄物必須收集在防漏,未破的容器內(nèi),經(jīng)高濃度的化學(xué)消毒劑處理.3)對(duì)剩余的標(biāo)本,接種過(guò)的培養(yǎng)基,菌種等丟棄前均須消毒.4)對(duì)于任何有污染的銳器如針頭,注射器,玻片等在處理前不要用手接觸.10/4/2023142.微生物實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)控

1)

對(duì)細(xì)菌檢驗(yàn)人員的要求;2)

操作手冊(cè);3)

儀器設(shè)備的功能監(jiān)測(cè);4)

培養(yǎng)基的質(zhì)量控制;5)

試劑,染色液以及抗血清的質(zhì)量控制;6)

標(biāo)本檢驗(yàn)的質(zhì)量控制;7)

標(biāo)準(zhǔn)菌株的來(lái)源和保存及室內(nèi)質(zhì)量的全面控制.

微生物檢驗(yàn)的室間質(zhì)評(píng)10/4/2023151.微生物檢查基本方法與診斷技術(shù)。2.微生物學(xué)檢驗(yàn)概述。內(nèi)容小結(jié)10/4/202316二、臨床常見的微生物及檢驗(yàn)方法(例）10/4/202317一、球菌

葡萄球菌(一)

生物學(xué)特性1.

形態(tài)與結(jié)構(gòu)：本菌屬G染色陽(yáng)性,呈圓球形,不規(guī)則成堆排列,形似葡萄串狀,無(wú)莢膜.無(wú)鞭毛和芽孢.2.

培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧,營(yíng)養(yǎng)要求不高.最適PH為7.4,經(jīng)37℃24—48h培養(yǎng),可形成圓形,凸起,表面光滑濕潤(rùn),邊緣整齊不透明的菌落,可產(chǎn)生不同的脂溶性色素,如白色,金黃色,檸檬色色素。在血平板上,幾乎所有的葡萄球菌可產(chǎn)生α,β,γ和δ溶血在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速生長(zhǎng)呈均勻混濁狀.10/4/202318

3)分類方法：根據(jù)其在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生的不同色素分為金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌和檸檬色葡萄球菌。1965年,國(guó)際葡萄球菌和微球菌分類委員會(huì)將葡萄球菌分為凝固酶陽(yáng)性和陰性葡萄（CNS）。CNS包括表葡、腐生葡萄球菌。凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌包括金葡、中間型和家畜葡萄球菌。

(二)

微生物檢查

1.標(biāo)本采集:膿汁,滲出液,分泌物,血,尿,糞便,痰液及腦脊液。2.檢查方法及鑒定10/4/202319

1)直接鏡檢涂片,G染色鏡檢,如為陽(yáng)性球菌呈葡萄狀排列可初診.初報(bào)為找到G陽(yáng)性葡萄狀排列球菌,疑為葡萄球菌。

2)分離培養(yǎng)膿汁,尿液.腦脊液等離心沉淀,可直接接種血平板。37℃18—24h培養(yǎng)可產(chǎn)生不同色素的菌落.金黃色葡萄球菌在周圍有透明溶血環(huán).3)鑒定試驗(yàn)a.觸酶試驗(yàn)：細(xì)菌產(chǎn)生的過(guò)氧化氫酶催化雙氧水生成水和氧氣,產(chǎn)生氣泡.b.血漿凝固酶試驗(yàn)：血漿凝固酶是金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的一種與其致病力有關(guān)的侵襲性酶,分游離型和結(jié)合型。其作用是血漿中的纖維蛋白在菌體表面沉積和凝固以阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬。10/4/202320c.甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)d.新生霉素敏感試驗(yàn)?zāi)堂戈幮缘钠咸亚蚓好舾袨楸砥て咸亚蚓?耐藥為腐生葡萄球菌。e.同時(shí)進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)本唑西林：MSS/MRSβ-內(nèi)酰胺酶萬(wàn)古酶素的敏感性。

金黃色葡萄球菌:觸酶+凝固酶+甘露醇+新生酶素S表皮葡萄球菌:+-+S腐生葡萄球菌:+-+R報(bào)告:檢出XXX葡萄球菌10/4/2023214)耐藥性檢測(cè):耐甲氧西林金葡菌（MRSA），

耐甲氧西林的表葡菌（MRSE）。5)

臨床意義：葡萄球菌感染的特點(diǎn)是感染部位組織的化膿，壞死和膿腫形成。金葡，表葡和腐生葡萄球菌是引起臨床感染最常見的葡萄球菌。①金葡菌引起癤，癰，外科傷口，創(chuàng)傷的局部化膿性感染，入血后可引起深部組織的化膿性感染。其產(chǎn)生的腸毒素可引起食物中毒，表現(xiàn)為急性胃腸炎。主要致病物質(zhì)有血漿凝固酶，葡萄球菌溶血素，殺WBC素，腸毒素，表皮溶解毒素和毒性休克綜合癥毒素②

表葡是存在于皮膚的正常菌群，由于各種導(dǎo)管植入和人造組織的使用，該菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，是導(dǎo)致血培養(yǎng)污染的常見菌之一。③

腐生葡萄球菌是導(dǎo)致尿路感染的常見菌之一。10/4/202322四、醫(yī)院感染與抗菌藥物敏感性試驗(yàn)10/4/202323一、醫(yī)院獲得性感染(hospitalacquiredinfection)：包括醫(yī)院內(nèi)各種人群所獲得的感染。對(duì)象——一切在醫(yī)院內(nèi)活動(dòng)的人群（主要為住院病人）地點(diǎn)——感染發(fā)生必須在醫(yī)院內(nèi)時(shí)間——病人在住院期間或出院后不久發(fā)生的感染，及與前次住院有關(guān)的感染。一、醫(yī)院感染10/4/202324

醫(yī)院感染的類型按微生物來(lái)源內(nèi)源性醫(yī)院感染——由自身正常菌群轉(zhuǎn)變成機(jī)會(huì)性致病菌所致特定條件——寄居部位改變

——免疫功能下降

——菌群失調(diào)外源性醫(yī)院感染（交叉感染）——患者遭受醫(yī)院內(nèi)非自身存在的病原體侵襲而發(fā)生的感染。病人之間、醫(yī)患之間、污染醫(yī)護(hù)用品或診治設(shè)備、環(huán)境空氣等，也稱醫(yī)院內(nèi)感染。按感染部位分類——全身各部位均可發(fā)生10/4/202325

易感宿主：主要是原發(fā)病引起機(jī)體抵抗力低下，接受影響免疫功能的藥物治療或接受侵襲性操作措施的病人。這些病人主要表現(xiàn)為局部或全身免疫功能受損，正常菌群被破壞，抑制外部細(xì)菌定植能力減弱或消失，使病人處于高度易感狀態(tài)。

醫(yī)院感染常見的微生物主要是機(jī)會(huì)性致病菌（常為內(nèi)源性感染）常為耐藥菌;新的病原菌不斷出現(xiàn);主要是細(xì)菌，其次為病毒和真菌。常見的微生物有：1．細(xì)菌葡萄球菌屬、微球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌科、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、軍團(tuán)菌、腦膜炎敗血性黃桿菌、結(jié)核桿菌、李斯特菌、類桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)桿菌、核梭桿菌、丙酸桿菌、消化球菌等。10/4/202326

2．真菌念珠菌、組織胞漿菌、球孢子菌、隱球菌、曲霉菌等。3．病毒肝炎病毒、水痘病毒、流感病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒等。4．對(duì)于機(jī)體的不同系統(tǒng)，醫(yī)院感染的病原菌也不同，

目前G陰性桿菌仍占主要地位，凝固酶陰性葡萄球菌及腸球菌感染率逐漸上升，尤其應(yīng)該注意的是MRSA及耐萬(wàn)古霉素腸球菌引起的醫(yī)院感染。10/4/202327二、監(jiān)控抗感染治療的實(shí)驗(yàn)室方法

(一)

抗菌藥物選擇原則：合理使用抗生素，應(yīng)根據(jù)病原學(xué)及其藥敏試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合抗生素的性能，藥理學(xué)情況及患者生理、病理、免疫狀態(tài)合理選用抗生素。(二)

抑菌試驗(yàn)原理及方法目前常用的方法是紙片瓊脂擴(kuò)散法，是一種半定量的方法。美國(guó)CLSI(NCCLS)紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)分委會(huì)所推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法是K—B法，此法是目前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法。10/4/202328

紙片瓊脂擴(kuò)散法

原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種待檢菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后會(huì)不斷地向紙片周圍區(qū)擴(kuò)散，形成遞減的剃度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)待檢菌的生長(zhǎng)被抑制，從而產(chǎn)生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反應(yīng)檢測(cè)菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該菌對(duì)待檢菌的最低抑菌濃度呈負(fù)相關(guān)。試驗(yàn)方法在純培養(yǎng)平板上挑取相同的菌落4-5個(gè)。用無(wú)菌生理鹽水調(diào)菌液為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬s含菌１Ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ），在15min內(nèi)接種完。10/4/202329用無(wú)菌棉試蘸取菌液，在試管壁上擠壓幾次，壓去多余的菌液，分三個(gè)方向即每次旋轉(zhuǎn)平板60°,使整個(gè)MH平板涂布均勻.涂布菌液的平板于室溫中干燥3-5min后,用紙片分配器或無(wú)菌鑷子取藥敏紙片,貼于平板表面,并用鑷尖輕壓一下紙片,使其貼平.每張紙片的間距不小于24mm,紙片的中心距平板的邊緣不小于15mm,90mm直徑的平板宜貼6張藥敏紙片.將貼好紙片的平板置35℃孵育18-24h后,用標(biāo)尺量取抑菌圈直徑.結(jié)果判斷根據(jù)量取抑菌圈的直徑（包含紙片的直徑），以毫米數(shù)報(bào)告（取整數(shù)）。(不同抗生素其抑菌圈大小的標(biāo)準(zhǔn)不一致),判斷為敏感(S)、耐藥(R)或中度敏感結(jié)果判讀。10/4/202330結(jié)果報(bào)告敏感（susceptible，S）：是指當(dāng)使用常規(guī)推薦劑量的抗菌藥物進(jìn)行治療時(shí)，該抗菌藥在患者感染部位所能達(dá)到的濃度可抑制該感染菌的生長(zhǎng)。耐藥（resistant，R）：是指使用常規(guī)推薦劑量的抗菌藥物進(jìn)行治療時(shí)，該抗菌藥在患者感染部位通常所能達(dá)到的濃度不能抑制該感染菌的生長(zhǎng)；或者該藥對(duì)該感染菌的臨床療效尚未在以往的治療研究中被證實(shí)是可靠的；或者抑菌圈直徑落在特定細(xì)菌發(fā)揮耐藥機(jī)制（如β-內(nèi)酰胺酶）的合適范圍。10/4/202331中介（intermesiate，I）抗菌藥對(duì)感染菌的MIC接近該藥在血液和組織中的濃度，感染菌的臨床應(yīng)答率可能低于敏感菌。根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)資料分析，若某藥在生理濃集部位具有臨床效力，如尿中喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺酶類藥物濃度較高，則中介意味著該藥治療該部位的感染可能有效；于之相反，若某藥由于通透性等原因在某個(gè)組織、器官或體液中濃度較低，甚至在炎癥的情況下濃度亦較低，如一些藥在腦脊液中，則中介意味著盡可能不用該藥進(jìn)行治療，而應(yīng)選用其他有效藥物.10/4/202332若某藥在高劑量使用時(shí)是安全的（如β-內(nèi)酰胺酶藥物），則中介意味著高劑量給藥可能奏效在判斷藥敏試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，中介的數(shù)據(jù)位置處于敏感與耐藥之間，它可作為一個(gè)緩沖帶，用以防止因?yàn)橐恍┬〉?、不能控制的技術(shù)因素而引起的結(jié)果解釋的偏差，特別對(duì)于那些藥毒范圍（pharmacotoxicitymargin）較窄的藥物來(lái)講這個(gè)緩沖帶相當(dāng)重要。10/4/202333局限性：體外試驗(yàn)敏感的，體內(nèi)不一定敏感。細(xì)菌室分離的病原菌不一定都是致病菌我國(guó)采用的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為