I型膠原殼聚糖復(fù)合材料生物相容性研究

=1\＊ＲＯＭANI型膠原－殼聚糖復(fù)合材料的生物相容性討論基金項(xiàng)目：國家自然基金項(xiàng)目(30973048)；科技部國際合作重點(diǎn)項(xiàng)目（2008GR0403）；國家人力資源與社會(huì)保障部2009年度留學(xué)回國人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目作者簡介：張永強(qiáng)（1985-），男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)殛P(guān)節(jié)軟骨的損傷與修復(fù)通訊作者：楊自權(quán)（1972-），男，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，e-mail:基金項(xiàng)目：國家自然基金項(xiàng)目(30973048)；科技部國際合作重點(diǎn)項(xiàng)目（2008GR0403）；國家人力資源與社會(huì)保障部2009年度留學(xué)回國人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目作者簡介：張永強(qiáng)（1985-），男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)殛P(guān)節(jié)軟骨的損傷與修復(fù)通訊作者：楊自權(quán)（1972-），男，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，e-mail:yzqonline@126.com衛(wèi)小春（1951-），男，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，碩士研究生導(dǎo)師,e-mail:weixiaochun06@張永強(qiáng)1任志鵬1楊自權(quán)１孫曉丹2衛(wèi)小春１１山西醫(yī)科高校其次醫(yī)院骨科骨與軟組織損傷修復(fù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室０3000１２清華高校材料工程學(xué)院【摘要】目的評價(jià)=１＼＊ROMＡNI型膠原—?dú)ぞ厶菑?fù)合材料作為組織工程支架材料的生物相容性。方法體外培育兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BＭSＣs）,采納四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測不同分組的BＭＳＣs生長情況，酶標(biāo)儀測吸光度值(OＤ)，計(jì)算細(xì)胞相對增值率（RＧR％)；利用材料浸提液與兔新奇血混合觀察紅細(xì)胞溶解情況，評價(jià)材料細(xì)胞生物相容性。結(jié)果空白組(Ａ組)，5０％濃度組(Ｂ組）和100%濃度組(Ｃ組）BMSCs均生長良好,并于1、3、5天逐漸增殖，陽性對比組（D組）細(xì)胞于第1天開頭變圓、皺縮，3天和5天均皺縮死亡.Ａ、B、Ｃ三組細(xì)胞在第1、３、5天各組吸光度值無顯著差異（P>０。０5),但均與Ｄ組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P〈０.05）。材料相對溶血率為4．1％。結(jié)論＝１＼＊ROMANI型膠原—?dú)ぞ厶菑?fù)合材料無明顯細(xì)胞毒性,有良好的生物相容性。【關(guān)鍵詞】膠原－殼聚糖材料；細(xì)胞毒性試驗(yàn)；溶血試驗(yàn)BｉｏcomｐatibｉｌityresｅarchｅsoftｙpｅIｃollagｅn－ｃhiｔｏsanｓcaｆfｏｌｄＺhangｙoｎｇｑiaｎg1，Renｚhｉpｅng1,Yａngziｑｕan1etal。1DepartmｅｎtoｆOrthoｐｅｄｉｃs，ｔhｅseconｄｈｏｓpitａlofShanxiMeｄicａｌUniｖersity,ｂoｎeaｎdsｏfｔtisｓueｈｅaliｎgKｅyLaboｒａt(yī)ｏｒyofＳhanxiProｖince；2TsinｇhuaＵniｖerｓity，IｎsｔituｔeofMａｔeriａｌsEnginｅe(cuò)rｉng［Abstｒａct］ＯbjeｃｔｉvｅＴoeｖalｕatethebioｃoｍpaｔibiｌiｔyｏｆｔｈetｙｐeIcolｌａgen-cｈiｔoｓanscａffｏldforｔiｓsueengineerinｇ。MetｈｏdsＣuｌturｅdｂoｎeｍarｒoｗｍesenｃｈｙｍａlｓtemceｌlｓ(BMＳCs）in4diffｅrenｔgroups(A，B,CandＤ)。Useｄtetraｚoliｕmsａlt(MＴＴ）ｃolｏｒimｅｔriｃtoassaythegｒowthｏｆdiffｅrｅnｔgroups，anｄmeaｓureｔheopｔicａｌdenｓiｔｙ（OＤ)ｂｙｍｉcｒoｐlａｔereader,ｔｈencａlculａｔeｔｈerｅlａｔｉvegrowｔhｒaｔe(RGR％）。Miｘedｔheｓｃaｆｆordｅxｔraｃｔｓwiｔｈｆrｅsｈbloｏｄofｔｈｅrabｂit，ｔheｇradｅｏfhｅmolysiswａsｍａｄeiｎthｅmｅaｓureｓoｆｏptｉcaldensitｙat492nｍ。RｅsultsＢMSCsoｆｇroupA，gｒｏｕpBanｄgroｕpＣｗeｒegrｏwｉngwell，ａnｄproliｆeｒatinggraduallｙiｎtｈe１ｓｔ,3rｄand5thday。Thｅpositiveｃontｒoｌｇrｏｕp(D)cellsroｕndedaｎdwｒinｋledinthｅ1stdａｙ,thｅn，ceｌｌsｗｅreｓhriｎｋａgeｄｅａt(yī)h．Thｅｏｐｔｉｃalｄenｓitywerenｏｓignｉfｉcaｎtstatisｔicaｌdｉｆfｅreｎceｓbetwｅe(cuò)ｎgroｕpA,BanｄC（P>０.０5),bｕｔａlｌｈadsiｇｎiｆｉcａｎtｓtａｔisｔicaｌdｉffｅrｅnceswithgroupD（Ｐ＜0．０5)。Hemolysiｓpｅrcｅｎｔagｅｏfthescａｆfｏrｄｗas4．1%。ConｃｌｕｓioｎI(lǐng)ｃoｌｌaｇen－ｃhiｔｏsaｎsｃafｆｏrdhａsnｏｓiｇnificaｎｔcｙtotｏｘｉｃitｙ，ａndaｃｃordｓwithtｈeｂioｍaterialstａndardsｏftisｓｕeｅｎgｉneerinｇ．[Ｋｅywｏrｄs］Icollageｎ－ｃhitｏsanscaffｏrd;Testofheｍｏlysiｓ；Ｔestfoｒｃｙtｏtoｘｉｃity殼聚糖是一種天然高分子生物材料,為線性多糖，是氨基多糖(ＧAＧ）的異構(gòu)物。在自然界中廣泛存在，是一種來源廣泛、容易獲得并具有良好生物相容性的可降解生物材料。I型膠原是很多組織的細(xì)胞外基質(zhì)成分,并已應(yīng)用于很多組織工程的支架材料中，但由于單獨(dú)應(yīng)用具有降解速率快、物理性能差等不足,因此常常與其他材料復(fù)合，以避開一些不足。本實(shí)驗(yàn)討論的＝1\＊ROMＡNI型膠原-殼聚糖復(fù)合材料是一種將=1\＊ROＭAＮI型膠原和殼聚糖有機(jī)結(jié)合的新型組織工程復(fù)合載體支架材料。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)是一類在離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境,檢測材料和器械接觸機(jī)體組織后生物學(xué)反應(yīng)的體外試驗(yàn)，它是對材料進(jìn)行生物學(xué)評價(jià)的重要檢測指標(biāo)之一.本實(shí)驗(yàn)通過四甲基偶氮唑鹽（ＭTT）比色法檢測材料浸提液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BＭＳＣｓ）生長的影響，同時(shí)進(jìn)行材料浸提液的溶血試驗(yàn)檢測，評價(jià)新型載體材料——=1＼＊ROMANI型膠原—?dú)ぞ厶菑?fù)合材料作為組織工程支架材料的生物相容性。材料與方法1主要試驗(yàn)材料、試劑和儀器=1\*RＯMANＩ型膠原—?dú)ぞ厶菑?fù)合材料（清華高校供應(yīng))；2月齡新西蘭大白兔（山西畜牧討論所）;胰酶(Sigmａ公司）;DＭＥＭ—F12(賽默飛世爾生物化學(xué)有限公司);胎牛血清（杭州四季青)；四甲基偶氮唑鹽（Sigｍａ公司）;苯酚（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；ＢＢ5０６０型CO２培育箱(Hｅraeuｓ公司)；MK3型酶標(biāo)儀(熱電上海儀器有限公司）。2細(xì)胞毒性試驗(yàn)2．1BMSCs的培育取2月齡新西蘭大白兔,稱重為3kｇ。耳緣靜脈注射3％戊巴比妥鈉（1ml/ｋｇ體重）約3ｍl麻妥,無菌條件下于雙側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子處穿刺,分別自兩側(cè)骨髓腔中抽取骨髓至含有2mｌ肝素（3000U/mｌ）注射器內(nèi)，置于離心管中沖洗離心后，各加含１0%胎牛血清DMEM—F1２培育基5ml,分裝于2個(gè)２５ｃm2培育瓶內(nèi),置入37℃,5％CＯ２飽和濕度的培育箱中培育。3d后首次換液，以后每2－3d換液一次。待細(xì)胞長滿瓶底達(dá)80—９0％(圖1)，進(jìn)行傳代，傳至三代（圖2）備用。浸提液的制備[１］（ＩＳO１０993－５）依據(jù)《GB/T1６886.5２20０3/ISO1０993-5:1９99醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》中的浸提液試驗(yàn),將材料按1cm2試樣表面積加1０ｍl浸提介質(zhì)比例在3７℃恒溫箱中浸提２4h.浸提介質(zhì)為含10％小牛血清的DMEM-Ｆ12培育液.2．3實(shí)驗(yàn)分組及檢測空白組（A組）：含10%小牛血清的DMEM-Ｆ12培育液50%濃度組（B組)：材料浸提液濃度為50％100％濃度組(Ｃ組):材料浸提液濃度為100%陽性對比組(D組):０.6４％苯酚取第三代BＭSCs,配制成１×105／mｌ細(xì)胞懸液,?。硥K９6孔培育板,每板4組,每組１0孔,每孔加1００ul細(xì)胞懸液,置于條件同前的培育箱中培育。２４小時(shí)后，棄去原培育液，用PBS液洗滌２次后,分別按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行換液,再把培育板放入原培育箱內(nèi)連續(xù)培育,分別于1、３、5天各取出一塊培育板，在倒置相差顯微鏡下觀察活細(xì)胞形態(tài)、攝影,然后加入２0ul孔MTT液，連續(xù)培育６小時(shí)，吸除原液，再加入150ul孔二甲基亞砜(DMSO),震蕩１０分鐘,在酶聯(lián)免疫檢測儀上以450nm波長測汲取值.按下式計(jì)算細(xì)胞相對增殖率（ＲGR）：ＲGR=（實(shí)驗(yàn)組吸光值/空白對比組吸光值）×10０%對所得RGR按美國藥典細(xì)胞毒性分級標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行毒性分級。美國藥典［2］(USPXXＩＩ24版）中細(xì)胞相對增殖率與細(xì)胞毒性的分級的關(guān)系（下表）TheｒelationｓhiｐｂetweｅnｃellproｌiferａｔioｎｒaｔeanｄcytoｔoｘicｉtyｇradeoｆUSP細(xì)胞相對增殖率（％）細(xì)胞毒性分級≥1000≥８01≥5０2≥30３≥04３溶血試驗(yàn)３。１采集新西蘭大白兔血４mL與2mL肝素（３０００Ｕ/ml)混合備用。3.２實(shí)驗(yàn)分組及檢測試驗(yàn)分組：生理鹽水組(陰性對比)、實(shí)驗(yàn)組(材料100％浸提液)和蒸餾水組(陽性對比組）。每組10個(gè)樣本,每個(gè)樣本5ｍＬ。取抗凝新奇血液０.１mL分別加入3組樣品中，3７℃培育箱孵育6０mｉn。觀察大體樣本溶血情況。低速離心機(jī)３000r/miｎ10ｍｉｎ,酶標(biāo)儀４９2nm下對樣品進(jìn)行OＤ值檢測。溶血率=（Dｔ—Dｎc)/(Ｄpc-Dｎｃ）×１00%按上述公式計(jì)算溶血率(Dｔ：待測OD值；Ｄpc:陽性對比OD值;Dnｃ：陰性對比OD值）.4統(tǒng)計(jì)分析對MＴT法及溶血試驗(yàn)測得各組吸光度值采納均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，并行單因素方差分析,用SＰＳS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果1細(xì)胞毒性試驗(yàn)1.１1天后倒置顯微鏡下觀察Ａ、Ｂ、Ｃ三組ＢMSＣs生長狀態(tài)均良好，細(xì)胞多呈梭形或多角形(圖3)。D組細(xì)胞無明顯生長，基本開頭變圓,皺縮（圖６a）.表1：細(xì)胞相對增殖度和細(xì)胞毒性等級（1天）組別OＤ值（SＤ,ｎ=１0)細(xì)胞相對增殖度RGR（％)細(xì)胞毒性等級A空白對比組０。３1８80.02２６100.00B５0%浸提液組０。30250.０331９4.９０Ｃ１00％浸提液組０。29９60．01３394。00Ｄ陽性對比組0。075４0。009９﹡２3．74“﹡”示:與A組比較Ｐ〈０.05.１.2第3天可見前三組細(xì)胞數(shù)明顯較前增多，細(xì)胞逐漸聚集融合.三組細(xì)胞生長狀況均良好,無明顯差異（圖４）.D組細(xì)胞皺縮死亡。（圖６ｂ）.表2:細(xì)胞相對增殖度和細(xì)胞毒性等級（3天）組別OＤ值（SＤ，n=１0)細(xì)胞相對增殖度RＧR(%）細(xì)胞毒性等級Ａ空白對比組0。43７00.05３２１０0。00B５０％浸提液組０.44９２０。05０6102.７0Ｃ100%浸提液組０。4５80０.0７931０４．8０D陽性對比組0。0７490.０036﹡1７.14“﹡”示：與A組比較P<０。0５。１。３第5天鏡下見Ａ、B、Ｃ三組BMＳCs數(shù)量較前明顯增多，且呈梭形，三角形（圖5)。D組細(xì)胞成片死亡（圖6ｃ)。表3：細(xì)胞相對增殖度和細(xì)胞毒性等級（５天）組別OD值（SD，n=10）細(xì)胞相對增殖度ＲGＲ（%）細(xì)胞毒性等級A空白對比組0．6９0７０.１105100。０0Ｂ50％浸提液組０.６5630．09099５.00Ｃ１０0％浸提液組0．62560．149８90．６0D陽性對比組0。0７19０．0014﹡10．４４“﹡"示：與A組比較P〈０。05。第1、3、５天A、B、C三組OＤ值均無明顯差異(P>0．０５）（如表4),細(xì)胞毒性等級均為０級。2溶血試驗(yàn)２。1樣本大體觀察生理鹽水組和實(shí)驗(yàn)組靜置后各管內(nèi)均可見血細(xì)胞沉積，而蒸餾水組各管顏色均一，呈淡紅色,無明顯血細(xì)胞沉積。2。2溶血率表5:吸光度值和溶血率(ＳＤ，n=10)生理鹽水組蒸餾水組實(shí)驗(yàn)組OＤ值0。05110。01４7０．453６０。0２８20.067８0.01０0溶血率0%１00%４。１%生理鹽水組與實(shí)驗(yàn)組OD值無明顯差異（P>0。05)，與蒸餾水組有差異(P〈0。05)。計(jì)算得材料相對溶血率為4.１％.商量在組織工程討論中,作為組織和細(xì)胞生長的載體，支架材料的選擇至關(guān)重要[3］(IsmaｒulIN,20０４)。=1\＊ＲOMＡNＩ型膠原－殼聚糖復(fù)合材料結(jié)合了膠原和殼聚糖材料的優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的組織工程支架材料。本實(shí)驗(yàn)通過四甲基偶氮唑鹽(MTＴ）比色法檢測材料浸提液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMＳCs)生長活性的影響，同時(shí)進(jìn)行材料浸提液的血液相容性檢測,進(jìn)而評價(jià)＝１\＊ＲOＭANI型膠原-殼聚糖復(fù)合材料的生物毒性。ＭＴT法最早是由Mｏsrｏaｎm于19８3年提出［４]（ＭoｓroanmT，198３），現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于對材料的細(xì)胞相容性的評價(jià)[5,6]（CiapettiG，1９９３;WaｔaｈaJC,19９4).其原理是線粒體琥珀酸脫氫酶能使四甲基偶氮唑鹽還原成藍(lán)色甲替,形成的多少與活細(xì)胞數(shù)量和功能狀態(tài)成正相關(guān)。因此可以從吸光度值(ＯＤ值)間接反映細(xì)胞數(shù)量和活力。在本實(shí)驗(yàn)中,空白組、５0％濃度組和1００%濃度組的細(xì)胞隨著培育時(shí)間的延長，三組ＯD值均逐漸增加,即細(xì)胞數(shù)量增加，表明50%和1０0%的＝1\*RＯMANI型膠原－殼聚糖復(fù)合材料浸提液對BMＳＣs的增殖無明顯影響。而陽性對比組隨著時(shí)間的延長，OD值逐漸減小，細(xì)胞數(shù)目削減，細(xì)胞死亡,表明0.64%的苯酚嚴(yán)重影響了BMSＣs的生長和增殖,并有細(xì)胞致死性.第1、3、５天,空白組、5０%濃度組和100％濃度組三組之間OＤ值無明顯差異(P＞0．0５），但均與陽性對比組有顯著差異（均P<0．05)。將50%和１０0%=1\*ROMＡNI型膠原-殼聚糖復(fù)合材料浸提液對BＭSCs的毒性檢測結(jié)果按美國藥典中細(xì)胞相對增殖率與細(xì)胞毒性的分級關(guān)系進(jìn)行分級，其細(xì)胞毒性均為０級。故=1\*ＲＯMANI型膠原－殼聚糖復(fù)合材料符合組織工程支架材料的無毒性要求.溶血試驗(yàn)被認(rèn)為是細(xì)胞毒性評價(jià)的一個(gè)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。其原理為血漿中血紅蛋白量上升指示溶血并反映出在與材料接觸中紅細(xì)胞膜的易裂開性。本實(shí)驗(yàn)中生理鹽水組和實(shí)驗(yàn)組靜置后各管內(nèi)均見到有血細(xì)胞的沉積，兩組OD值無明顯差異（P〉0.0５)。而蒸餾水組各管顏色均一，呈淡紅色，表現(xiàn)為明顯溶血的現(xiàn)象，其ＯD值與生理鹽水組和實(shí)驗(yàn)組均有顯著差異(均P<０.０5).最終求得材料浸提液相對溶血率為4．1％,符合溶血率〈5%的標(biāo)準(zhǔn)要求[７］（ＩSO１099３—4)。進(jìn)一步補(bǔ)充說明白＝1\*ROＭＡNI型膠原—?dú)ぞ厶菑?fù)合材料的無毒性.抱負(fù)的骨組織工程支架材料除了對機(jī)體無毒性以外，還應(yīng)具有良好的表面相容性,肯定的生物活性，可降解性和良好的結(jié)構(gòu)相容性等［8］(HunzikeｒE,１9９９）。所以對于=１＼＊RＯMANI型膠原—?dú)ぞ厶菑?fù)合材料還需從這些方面進(jìn)一步討論。圖３第1天：A,Ｂ，Ｃ三組細(xì)胞均生長良好，細(xì)胞呈梭形或三角形（圖３第1天：A,Ｂ，Ｃ三組細(xì)胞均生長良好，細(xì)胞呈梭形或三角形（×１００)圖１圖2原代ＢＭSCs細(xì)胞（×１00)三代ＢMSCｓ細(xì)胞(×100)圖4圖4第3天：Ａ，B,C三組BMSCs數(shù)量較前增多,生長良好(×1００)圖５第5天:A,B,Ｃ三組各孔ＢＭSCｓ趨于融合，細(xì)胞生長良好。圖6ａ,b，c分別表示第1，3,５天Ｄ組BMSＣs變圓,固縮,死亡。圖6ａ,b，c分別表示第1，3,５天Ｄ組BMSＣs變圓,固縮,死亡。參考文獻(xiàn)[１］ISO10９93—５：1９99Biｏlｏgicａｌevａｌuａt(yī)ｉonofｍedｉcaldevicｅs—Pａｒt5:Tesｔsｆorinviｔｒｏcytoｔｏxｉciｔy。［2]USPXＸII24。BiloｌgicａlＴests／BiologｉcａｌＲeａcｔｉviｔyTｅｓｔｓ,Invivo．[3]IｓｍaｒｕlIN，ＩshaｋＹ，IsmaiｌZ，eｔa１。Chａｒａｃｔｅｒizaｔioｎoｆcollａgｅn/ｃhitosａnfilmｓfoｒｓｋｉnｒegeｎｅratinｇscaffoｌｄ。Med