不同炮制時(shí)間蜂糧的ph值和花粉活力測(cè)定

不同炮制時(shí)間蜂糧的ph值和花粉活力測(cè)定

大多數(shù)蜜蜂（采集蜂蜜營(yíng)養(yǎng)）儲(chǔ)存在蜜蜂總科中（吳艷如，2000）。蜂糧也稱蜂面包、蜂巢花粉,是以花粉為主要原料釀制而成,作為蜜蜂幼蟲(chóng)的食料(繆正瀛,2000;吳燕如,2000;Nagaietal.,2004;嵇保中等,2006)。貯備的蜂糧在巢房中有一個(gè)復(fù)雜的微生物區(qū)系變化和生物化學(xué)變化過(guò)程(袁耀東,1991;蘇松坤,2000),一個(gè)重要的特征是酸度增強(qiáng),一般新鮮的蜂花粉pH值大約為7.2,釀貯成熟的蜂糧pH值一般減少到3.4～4.2(Isidorovaetal.,2009)。新鮮茶蜂花粉的pH值為5.63,1日齡蜂糧的pH值降低到4.33,15日齡蜂糧的pH值降到最低,為3.84,呈酸性(蘇松坤等,2002)。蜂糧與新鮮蜂花粉相比,具有良好的耐貯存性。耐貯存性與蜂糧本身的pH值降低有關(guān)(Fujiwaraetal.,1990;Gilliametal.,1997;蘇松坤,2002)。大多數(shù)細(xì)菌所要求的最適pH為6.5～8.0,引起傷口感染的金黃色葡萄球菌的最適pH值為7.0～7.5(郭善利,1998)。因此,蜂糧在釀制后期的酸性物質(zhì)和酸性空間不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖,從而可以大大延長(zhǎng)其保質(zhì)期。蜜蜂蜂糧釀制過(guò)程中,花粉很快失去萌發(fā)力,從而延長(zhǎng)蜂糧的新鮮度和保質(zhì)期。蘇松坤等(2002)采用氯化三苯基四氮唑(TTC)花粉活性測(cè)定法測(cè)定蜜蜂茶花粉蜂糧樣品中花粉粒的活力。在釀制過(guò)程中隨釀制時(shí)間的延長(zhǎng)花粉逐漸失去活力,在第5d花粉生活力完全失去活性。有報(bào)道蜂糧中花粉失去萌發(fā)力是因?yàn)樵诿鄯溽勝A蜂糧的過(guò)程中加入了唾腺分泌物10-羥基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decylennicacid,10-HDA),在10-HDA的作用下花粉粒很快喪失了發(fā)芽力;有報(bào)道10-HDA對(duì)植物的花粉萌發(fā)、花粉管伸長(zhǎng)和生殖核的有絲分裂有強(qiáng)烈的抑制作用(許雅香等,2000);但是,茶花粉蜂糧中沒(méi)有檢測(cè)到10-HDA(蘇松坤,2000)。長(zhǎng)木蜂Xylocopatranquebarorum(Swederus)屬于林業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的野生蜂類,其蜂糧在巢室中能長(zhǎng)期自然放置并保持新鮮狀態(tài)而不變質(zhì)(羅祿怡等,1992;賀春玲等,2009)。關(guān)于長(zhǎng)木蜂蜂糧在釀制過(guò)程中pH值的變化和釀制的不同階段花粉活力狀況在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道,我們?cè)诿鞔_了長(zhǎng)木蜂蜂糧的釀貯過(guò)程和蜂糧的采集最佳時(shí)期后(賀春玲,2009),對(duì)長(zhǎng)木蜂釀制過(guò)程中的pH和花粉活力進(jìn)行測(cè)定和報(bào)道,為進(jìn)一步揭示長(zhǎng)木蜂蜂糧的防腐機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1花溪園,南鄰玄武湖,東財(cái)務(wù)金山南京情侶園花卉公園。該公園位于南京城北,南鄰玄武湖,東枕紫金山,園內(nèi)花卉種類繁多且規(guī)模較大。其位置與南京林業(yè)大學(xué)毗鄰,試驗(yàn)采集和觀察均很便利。1.2樣品采集1.2.1植物花粉的采集2008年3月下旬～5月下旬,在南京情侶園花卉公園根據(jù)長(zhǎng)木蜂采訪的植物種類,在植物的盛花期采集已經(jīng)盛開(kāi)的植物花粉,用無(wú)菌的鑷子取其花粉放入滅菌的5mL離心管中,低溫條件下帶回實(shí)驗(yàn)室,4℃保存?zhèn)溆?。采集的植物花粉?紫藤Wisteriasinensis、芍藥Paeonialactiflora。1.2.2木蜂花粉的制備長(zhǎng)木蜂花粉是指長(zhǎng)木蜂將采集的花粉卸巢后,未進(jìn)行吐蜜濕潤(rùn)前的花粉。采集對(duì)象:主要為芍藥長(zhǎng)木蜂花粉和紫藤長(zhǎng)木蜂花粉。采集方法:將標(biāo)記的供長(zhǎng)木蜂筑巢的竹竿捆綁在芍藥園和紫藤藤架附近,待長(zhǎng)木蜂營(yíng)巢和正常采粉,將竹竿帶回實(shí)驗(yàn)室,無(wú)菌操作室解剖長(zhǎng)木蜂巢室,用無(wú)菌的長(zhǎng)柄藥勺取出卸入巢內(nèi)的花粉,放入滅菌的5mL離心管中,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.3采集蜂糧的方法將解剖巢室獲得的蜂糧放入已滅菌干燥的150mL廣口瓶中。根據(jù)卵的新鮮程度和長(zhǎng)木蜂釀制蜂糧的進(jìn)度,判斷蜂糧的日齡。將產(chǎn)卵一致的蜂糧放在同一廣口瓶中,用無(wú)菌的玻璃棒將采集到的蜂糧攪拌均勻,壓實(shí),用封口膜密封,室溫放置備用。未產(chǎn)卵的蜂糧定為0日齡蜂糧;雌蜂已經(jīng)在蜂糧上產(chǎn)卵,且卵為乳白色表面有鮮亮光澤,雌蜂向外制作的巢室隔板尚未完成(天氣晴好的條件下),此時(shí)的蜂糧定為1日齡蜂糧;然后每天定時(shí)從1日齡蜂糧中取樣,分別標(biāo)記為2、3、4……40日齡蜂糧。按照上述方法,在2008年4月下旬采集了紫藤花粉、紫藤長(zhǎng)木蜂花粉和不同釀制階段的蜂糧;在2008年5月1日和5月4日分別采集了芍藥花粉、芍藥長(zhǎng)木蜂花粉和不同釀制階段的蜂糧。1.3花粉純度的測(cè)定采用鏡檢計(jì)算法(徐景耀和莊元忠,1991)檢測(cè)芍藥(紫藤)花粉、芍藥(紫藤)長(zhǎng)木蜂花粉及不同釀制階段芍藥(紫藤)長(zhǎng)木蜂的花粉純度。具體方法:用無(wú)菌鑷子從各樣品中取少量的花粉放入滴有200μL滅菌水的凹面載玻片的凹槽內(nèi),用鑷子輕輕地將花粉攪拌均勻,立即觀察各樣品花粉的純度。每樣品3個(gè)重復(fù),每樣品隨即觀察6個(gè)視野,共觀察18個(gè)視野。用顯微拍照系統(tǒng)進(jìn)行拍照,統(tǒng)計(jì)不同樣品的花粉純度,以觀察到的18個(gè)視野的花粉純度百分?jǐn)?shù)的平均值作為該樣品的花粉純度。1.4樣品處理及配制將2008年5月1日采集的樣品和從其樣品中連續(xù)取樣的樣品記為樣品1,5月4日采集的樣品和從其樣品中連續(xù)取樣的樣品記為樣品2。分別稱取樣品1、2中的芍藥花粉、芍藥長(zhǎng)木蜂花粉、0、1、2、3、……15、20、30、40日芍藥蜂糧樣品各300mg于干凈的10mL離心管中,加入2.7mL去離子水,用漩渦振蕩器充分搖勻,用pH計(jì)直接測(cè)定兩次樣品溶液的pH值,每樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。兩次樣品的平均值的平均值即為該樣品的pH值(蘇松坤等,2002)。1.5花粉管長(zhǎng)度和溫度對(duì)菌的影響用移液槍取200μL無(wú)菌水滴入滅菌凹面載玻片的凹槽內(nèi),用無(wú)菌的鑷子將不同樣品的花粉均勻地灑在水滴上,放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中,置于25℃的恒溫箱內(nèi)保濕培養(yǎng),12h后觀察花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)情況。花粉管長(zhǎng)度為花粉粒直徑一半以上記為萌發(fā),每處理2重復(fù),每重復(fù)隨機(jī)觀察5個(gè)視野,每個(gè)視野的花粉粒數(shù)均在80個(gè)以上。花粉管長(zhǎng)度的觀測(cè),是在顯微鏡下用測(cè)微尺測(cè)量花粉管的長(zhǎng)度(樣本數(shù)10)。花粉萌發(fā)率(%)=(萌發(fā)花粉數(shù)/總花粉數(shù))×100。1.6儀器測(cè)試數(shù)據(jù)采集采用多功能型全自動(dòng)菌落/顯微圖像分析儀進(jìn)行;采用MicrosoftExcel表格處理軟件和SPSSBaseVer13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1不同日齡蜂糧樣品的花粉純度差異長(zhǎng)木蜂在貯備蜂糧期間,采集的花粉、蜂花粉和蜂糧之間花粉的純度變化如表1～3。紫藤花粉系列:紫藤長(zhǎng)木蜂花粉與不同日齡的蜂糧樣品之間的花粉純度差異顯著,而不同日齡的蜂糧樣品之間的花粉純度差異不顯著,紫藤長(zhǎng)木蜂花粉的純度最高為100%(表1)。芍藥花粉系列:芍藥長(zhǎng)木蜂花粉的純度最高,為(95.5±4.61)%,不同日齡蜂糧樣品的芍藥花粉純度均在93%以上,通過(guò)方差分析結(jié)果表明芍藥長(zhǎng)木蜂花粉和不同日齡的蜂糧樣品之間的花粉純度差異不顯著(表2、表3)。長(zhǎng)木蜂采集紫藤花粉釀貯的蜂糧中的花粉純度略高于采集芍藥花粉釀貯的蜂糧中的花粉的純度。林間觀察發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)木蜂在貯備蜂糧期間采集花粉的植物種類比較集中,不隨意更換。2.2ph測(cè)量的結(jié)果2.2.1樣品的ph值測(cè)定對(duì)樣品1和樣品2中的手采新鮮的芍藥花粉、芍藥長(zhǎng)木蜂花粉、0、1、2……40日齡的長(zhǎng)木蜂蜂糧樣品的pH值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4,樣品1和樣品2中的芍藥花粉、芍藥長(zhǎng)木蜂花粉和不同釀制時(shí)間的蜂糧樣品,其pH值變化趨勢(shì)一致,對(duì)于同一日齡條件下不同采集時(shí)間的樣品其pH值差別不大。2.2.2蜂糧的ph值測(cè)定手采新鮮芍藥花粉、芍藥長(zhǎng)木蜂花粉、0、1、2、3、4、5、6、30、40日齡蜂糧的pH值,結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,長(zhǎng)木蜂芍藥蜂花粉貯存在巢房以后,其pH值隨蜂糧日齡的增加而降低,芍藥花粉的pH值為6.19,芍藥長(zhǎng)木蜂花粉的pH值為5.92。0日齡蜂糧和1日蜂糧的pH值相同,均為5.82;從蜂花粉到蜂糧,pH值有所下降,但降低趨勢(shì)不明顯。2日蜂糧到3日蜂糧pH值從5.57降到4.84,降低趨勢(shì)明顯,3日以后蜂糧pH值逐漸下降,15日蜂糧的pH值為4.25,20日蜂糧的pH值為4.17,30日蜂糧的pH值為4.06,40日蜂糧的pH值為4.05,30日之后蜂糧pH值基本穩(wěn)定不變。2.3花粉?；盍y(cè)定結(jié)果2.3.1花粉管長(zhǎng)度變化手采芍藥花粉、芍藥長(zhǎng)木蜂花粉、1日、2日、3日、4日蜂糧樣品中花粉?；盍Ψ謩e為46.76%、26.12%、6.73%、5.12%、0、0(表5)。從1日齡基本喪失萌發(fā)力,3日齡以后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有活力的花粉粒。芍藥花粉的長(zhǎng)木蜂糧,1日齡花粉粒就基本喪失了萌發(fā)力,3日齡以后未發(fā)現(xiàn)有活力的花粉粒。芍藥長(zhǎng)木蜂蜂糧在釀制過(guò)程中花粉管長(zhǎng)度差異明顯,手采芍藥花粉的花粉管長(zhǎng)度為(27.39±12.24)μm,芍藥長(zhǎng)木蜂花粉的花粉管長(zhǎng)度為(13.12±3.81)μm,1日齡蜂糧和2日齡蜂糧中花粉的花粉管長(zhǎng)度分別為(4.65±4.27)μm和(4.26±2.55)μm。由花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度的結(jié)果可以看出,芍藥長(zhǎng)木蜂蜂糧在釀貯過(guò)程中,芍藥花粉的花粉粒萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)均收到很大抑制,花粉萌發(fā)活性很快喪失。2.3.2花粉管長(zhǎng)度的變化不同樣品的花粉活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。手采紫藤花粉、紫藤長(zhǎng)木蜂花粉、1、2、3、4日蜂糧樣品中花粉?；盍Ψ謩e為38.91%、10.58%、4.07%、3.15%、0、0;紫藤長(zhǎng)木蜂蜂糧在釀制過(guò)程中,不同樣品的花粉萌發(fā)的花粉管長(zhǎng)度差異明顯,手采紫藤花粉的花粉管長(zhǎng)度為(57.18±23.13)μm,紫藤長(zhǎng)木蜂花粉的花粉管長(zhǎng)度為(12.7±8.6)μm,1日齡蜂糧和2日齡蜂糧中花粉的花粉管長(zhǎng)度分別為(4.67±4.09)μm和(4.27±3.93)μm。其花粉活力的變化趨勢(shì)和2.3.1中芍藥花粉系列的變化趨勢(shì)基本一致。3結(jié)論和討論3.1不同藝術(shù)類型的花粉純度檢測(cè)不同粉源的蜂花粉,其營(yíng)養(yǎng)成分和其它性質(zhì)相差甚遠(yuǎn),所以樣品中花粉純度高低會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性(蘇松坤,2000)。Gilliam(1989)對(duì)杏仁花的手采花粉、蜂花粉和1、3、6周蜂糧樣品進(jìn)行細(xì)菌、酵母菌和霉菌的分離試驗(yàn)前,根據(jù)花粉粒的顏色和大小,對(duì)杏仁花粉蜂糧中的花粉純度進(jìn)行檢測(cè),其蜂糧中杏仁花粉的純度為99.8%。蘇松坤(2000)在蜂糧的釀制機(jī)理和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值研究中,對(duì)茶花粉蜂糧中茶花粉的純度進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果蜜蜂茶花粉蜂糧在不同釀制階段的花粉純度均在91%以上,并且不同釀制階段蜂糧樣品中花粉純度沒(méi)有明顯差異。長(zhǎng)木蜂屬于多訪花性蜂類,根據(jù)植物不同花期而改變?cè)L花植物類型,本實(shí)驗(yàn)分別以紫藤花粉和芍藥花粉作為研究對(duì)象,分析了長(zhǎng)木蜂在貯備蜂糧過(guò)程中花粉純度。紫藤花粉為扁球形,大小為33(±0.5)×23(±0.5)μm,具3孔溝,溝長(zhǎng),外壁紋飾為桔皮狀,且有凹陷(胡蕙露,2001)。芍藥花粉呈淡黃色,大部分為正常規(guī)則的大花粉,少數(shù)為異常不規(guī)則的小花粉。正?；ǚ哿５某嗟烂嬗^呈長(zhǎng)矩圓形,兩極大多數(shù)呈平截形,少數(shù)為圓弧形和圓尖形等;極面觀為近三角形,具3孔溝,溝很長(zhǎng)?；ǚ哿１砻婢呔W(wǎng)狀或小孔狀紋飾,網(wǎng)孔大小不一致,且網(wǎng)孔直徑均從赤道軸到兩極逐漸遞減,大部分網(wǎng)紋較平滑,少數(shù)較粗糙(金飚等,2005)。鏡檢結(jié)果顯示,不論長(zhǎng)木蜂是采集紫藤花粉還是芍藥花粉釀制蜂糧其花粉的純度都較高,均在93%以上,紫藤花粉的純度相對(duì)高于芍藥花粉的純度,可能是紫藤植物屬于藤本植物類型,花架較高,開(kāi)花早,其它花粉通過(guò)空氣的流動(dòng)受感染的可能性要小;而芍藥植物屬于小灌木,植株較矮,開(kāi)花期和其它很多植物的開(kāi)花期相一致,因此受其它花粉植物的感染可能性也較大,但在觀察中發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)木蜂在貯備同一塊蜂糧過(guò)程中采集花粉不僅具有專一性,并且獨(dú)棲性的長(zhǎng)木蜂貯備蜂糧由雌蜂獨(dú)立完成,這可能是長(zhǎng)木蜂蜂糧中花粉純度較高的另一原因。3.2不同日齡蜂糧的ph值分布情況長(zhǎng)木蜂蜂糧的pH值隨釀制時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減小,其研究結(jié)果與蘇松坤(2002)研究蜜蜂茶花粉蜂糧的pH值變化結(jié)果相一致,但樣品測(cè)定過(guò)程中,0日齡蜂糧pH值,樣品1為5.67,樣品2為5.97;2日齡蜂糧pH值,樣品1為5.72,樣品2為5.41;兩次樣品pH值的差值相對(duì)較大,初步分析該誤差與取樣有關(guān),長(zhǎng)木蜂在筑巢后,我們對(duì)巢口進(jìn)行標(biāo)記,從標(biāo)記開(kāi)始計(jì)算長(zhǎng)木蜂釀貯蜂糧的時(shí)間,但不同的雌蜂在釀貯蜂糧的時(shí)間以及采集粉蜜用時(shí)都有顯著差異(賀春玲等,2009),0日齡蜂糧為雌蜂未產(chǎn)卵的蜂糧。在取樣時(shí),0日齡蜂糧樣品很難把握長(zhǎng)木蜂的釀制進(jìn)度,雌蜂完成蜂糧團(tuán)塊大小不同,蜂糧在巢室中存貯時(shí)間的差異,從而導(dǎo)致0日齡蜂糧pH值出現(xiàn)誤差。2日齡蜂糧是將采集的1日齡蜂糧進(jìn)行攪拌、壓實(shí)后,定時(shí)從中取得,在攪拌和壓實(shí)時(shí)認(rèn)為操作,不好把握攪拌的輕重和壓實(shí)的松緊度,有可能由于此原因?qū)е碌?但有關(guān)具體原因還有待進(jìn)一步研究。環(huán)境的pH值與微生物生命活動(dòng)有著密切的關(guān)系,環(huán)境pH值不同,會(huì)造成生物膜電荷的改變,進(jìn)而引起膜離子通透性變化,從而影響微生物的生長(zhǎng)發(fā)育(蘇松坤,2000)。一般而言,酸性環(huán)境有利于物質(zhì)保存。本文的研究結(jié)果表明,長(zhǎng)木蜂蜂糧釀制過(guò)程中的快速酸化,可能是蜂糧能長(zhǎng)期保鮮的重要原因之一。其研究結(jié)果與蘇松坤(2002)的研究結(jié)果相一致,蘇松坤(2002)采用從茶蜂糧中分離出的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)行接種試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)釀制初期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(如植