土壤微生物生物量的測(cè)定

《土壤微生物生物量的測(cè)定-底物誘導(dǎo)呼吸法》編制說(shuō)明（征求意見(jiàn)稿）《土壤微生物生物量的測(cè)定-底物誘導(dǎo)呼吸法》編制組二0一二年十二月一日TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"1、項(xiàng)目背景 1.\o"CurrentDocument"2、標(biāo)準(zhǔn)制修定的必要性分析 1.\o"CurrentDocument"土壤微生物生物量的研究意義重大 1\o"CurrentDocument"土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化與土壤科研工作的需要 2\o"CurrentDocument"3、土壤微生物生物量研究方法的歷史 3.\o"CurrentDocument"4、標(biāo)準(zhǔn)編制的原則 4.\o"CurrentDocument"5、標(biāo)準(zhǔn)制定的目標(biāo)、主要技術(shù)內(nèi)容及說(shuō)明 5\o"CurrentDocument"方法研究的目標(biāo) 5.\o"CurrentDocument"適用范圍 5.\o"CurrentDocument"術(shù)語(yǔ)和定義 5.\o"CurrentDocument"原理 6.\o"CurrentDocument"測(cè)量條件 6.\o"CurrentDocument"試劑與材料 6.\o"CurrentDocument"分析步驟 6.\o"CurrentDocument"結(jié)果計(jì)算 6.\o"CurrentDocument"6、對(duì)實(shí)施本標(biāo)準(zhǔn)的建議 7.\o"CurrentDocument"7、參考文獻(xiàn) 7.#1、項(xiàng)目背景為了更好地監(jiān)測(cè)土壤的質(zhì)量和保護(hù)土壤環(huán)境，根據(jù)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)文件國(guó)標(biāo)委綜合【2011】82號(hào)《關(guān)于下達(dá)2011年第三批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》，《土壤微生物生物量的測(cè)定-底物誘導(dǎo)呼吸法》順利立項(xiàng)。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所和中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所共同承擔(dān)，計(jì)劃編號(hào)201111824-T-326。2012年5月，中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所接到轉(zhuǎn)化《Soilquality-Determinationofsoilmicrobialbiomass-Part1Substrateinducedrespirationmethod》(ISO142402-1:1997)的任務(wù)后，立即成立了標(biāo)準(zhǔn)編制組，小組成員包括多年從事土壤微生物分析研究和熟悉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制的專(zhuān)家。土壤微生物生物量是土壤有機(jī)質(zhì)最活躍和最易變化的部分，而且與土壤碳、氮、磷、硫等養(yǎng)分的循環(huán)密切相關(guān)，可直接或間接反映土壤肥力和土壤環(huán)境質(zhì)量的變化。目前土壤微生物生物量測(cè)定應(yīng)用較為廣泛的方法有底物誘導(dǎo)呼吸法、熏蒸提取法等，但未制定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，土壤微生物生物量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的編制，可以規(guī)范土壤微生物生物量的測(cè)定方法和擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，有利于人們更好地了解土壤-微生物-植物-環(huán)境相互作用。2、標(biāo)準(zhǔn)制修定的必要性分析土壤微生物生物量的研究意義重大土壤微生物生物量(soilmicrobialbiomass)是指生物體積小于5X103Rm3活的微生物總量，但不包括活的植物體，如植物根系等(吳金水等，2006；李振高等，2008)。廣義的土壤微生物量應(yīng)包括微生物碳、氮、磷、硫。眾所周知，土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分(C,N,P,S等)轉(zhuǎn)化和循環(huán)的驅(qū)動(dòng)力，它參與有機(jī)質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成、養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)的各個(gè)生化過(guò)程(林先貴，2010)。土壤微生物生物量雖然只占土壤有機(jī)質(zhì)的3%左右，但其作為土壤養(yǎng)分的儲(chǔ)存庫(kù)和植物生長(zhǎng)可利用養(yǎng)分的重要來(lái)源，與微生物個(gè)體數(shù)量指標(biāo)相比，更能反映微生物在土壤中的實(shí)際含量和作用潛力。據(jù)估計(jì)植物吸收N、P、S的60%，47%和28%分別來(lái)自微生物量N、P和S。而且，微生物是土壤中活的生命體，對(duì)土壤各種環(huán)境因子的變化極為敏感，因而微生物量的變化常被作為土壤肥力、土壤環(huán)境污染、其他各種擾動(dòng)對(duì)土壤健康影響的靈敏性指標(biāo)。因此，了解土壤微生物生物量有助于更好地理解影響土壤健康的主要因素，亦對(duì)制定良好措施來(lái)提高土壤質(zhì)量有重要意義。土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化與土壤科研工作的需要土壤微生物量是植物有效養(yǎng)分的儲(chǔ)備庫(kù)和源，其對(duì)土壤碳、氮、磷和硫的植物有效性及在陸地生態(tài)系統(tǒng)的循環(huán)具有重要的影響。土壤微生物生物量庫(kù)的長(zhǎng)期或是季節(jié)性變化都可作為土壤質(zhì)量的可靠的指示，對(duì)于了解土壤養(yǎng)分的動(dòng)態(tài)變化具有重要的作用。土壤微生物生物量是一種可快速測(cè)定和重復(fù)性好的參數(shù)，也可以用于對(duì)土壤的粗略比較以及反映土壤管理的改變和污染的影響。土壤微生物生物量的定量分析是了解微生物對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)與養(yǎng)分循環(huán)和轉(zhuǎn)化作用的重要方法。土壤微生物生物量的測(cè)定方法既有傳統(tǒng)方法，也有現(xiàn)代方法。在20世紀(jì)初發(fā)展起來(lái)的微生物計(jì)數(shù)方法至今仍在應(yīng)用。同時(shí)隨著土壤生物學(xué)和生物化學(xué)的不斷發(fā)展，新的方法也層出不窮。在土壤微生物生物量測(cè)定方法中，底物誘導(dǎo)呼吸法是加~?仙0口&Domsch（1978）首先提出的，根據(jù)添加的易分解底物在培養(yǎng)初期的分解速率來(lái)估計(jì)土壤微生物生物量。該方法操作簡(jiǎn)單，耗費(fèi)低，準(zhǔn)確度較高，是土壤微生物生物量分析中的經(jīng)典方法。該方法已形成了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，為了擴(kuò)大土壤微生物生物量的測(cè)定方法的應(yīng)用范圍，以及在土壤科學(xué)的科研工作中測(cè)定土壤微生物生物量指標(biāo)時(shí)形成準(zhǔn)確的、統(tǒng)一、可比較的數(shù)據(jù)，制定《土壤微生物生物量-底物誘導(dǎo)呼吸法》的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)十分必要。國(guó)家及土壤質(zhì)量主管部門(mén)的要求目前，我國(guó)越來(lái)越重視標(biāo)準(zhǔn)化工作，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定的工作任務(wù)中要求形成我國(guó)自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的適合我國(guó)土壤質(zhì)量監(jiān)測(cè)與分析的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。借此機(jī)遇，土壤科研領(lǐng)域的專(zhuān)家成立了“全國(guó)土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)”，以期大力發(fā)展土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化工作，逐漸構(gòu)建我國(guó)土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化體系。根據(jù)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)文件國(guó)標(biāo)委綜合【2011】82號(hào)《關(guān)于下達(dá)2011年第三批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》的要求，全國(guó)土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)有15個(gè)土壤質(zhì)量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委的審批并立項(xiàng)，“土壤微生物生物量-底物誘導(dǎo)呼吸法”即為其中的一個(gè)項(xiàng)目。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定工作的任務(wù)及土壤質(zhì)量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定的需要，完成該標(biāo)準(zhǔn)的制/修訂，對(duì)于指導(dǎo)我國(guó)土壤質(zhì)量監(jiān)測(cè)與監(jiān)管有重要意義。3、土壤微生物生物量研究方法的歷史早在20世紀(jì)70年代，土壤微生物學(xué)研究者采用土壤微生物細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，從土壤中提取和計(jì)數(shù)微生物的數(shù)量，但此種方法僅能獲得土壤中極少部分微生物，且不能得到有關(guān)這部分微生物活性方面的信息，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足對(duì)土壤微生物特征的描述及研究其對(duì)土壤的重要作用。由于傳統(tǒng)的土壤微生物細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，提取和培養(yǎng)方法存在的不足，使得到的結(jié)果重復(fù)性較差，甚至相差3個(gè)數(shù)量級(jí)。盡管如此，培養(yǎng)計(jì)數(shù)法在很長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)仍然是微生物學(xué)家了解土壤微生物數(shù)量的基本方法。培養(yǎng)計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是適合于對(duì)某些特殊土壤微生物的研究，但在使用該方法時(shí)應(yīng)反復(fù)檢查其適應(yīng)性。到1976年Jenkinson和Powlson提出間接法測(cè)定微生物生物量后，土壤微生物生物量庫(kù)在生態(tài)學(xué)和微生物學(xué)上才得到重視。該方法是基于氯仿熏蒸將土樣中微生物細(xì)胞殺死和溶解，再用土壤接種，測(cè)定培養(yǎng)10天內(nèi)土樣的呼吸，與未熏蒸對(duì)照土樣比較，由于熏蒸土樣微生物被殺死和微生物生物碳的分解，從而使釋放的CO2增加。該方法稱(chēng)為熏蒸一培養(yǎng)法（FI）。與此同時(shí)還提出采用FI法測(cè)定土壤微生物生物量氮。Anderson等在1978年提出了測(cè)定微生物生物量的另一生理學(xué)方法，即所謂的底物誘導(dǎo)呼吸法（Substrate-inducedrespiration，SIR）。該方法主要基于微生物在純培養(yǎng)時(shí)對(duì)易利用底物（如葡萄糖）供應(yīng)在呼吸作用上有直接的響應(yīng)，由此推斷易利用底物引起的呼吸量變化與土壤微生物生物量碳呈線(xiàn)性關(guān)系。FI和SIR法都有其不足之處。FI法需較長(zhǎng)時(shí)間（10天），且不適合酸性土壤。SIR法是采用FI法校準(zhǔn)，不同的校正系數(shù)使采用SIR測(cè)定的數(shù)據(jù)計(jì)算得到的微生物生物量碳常常會(huì)產(chǎn)生爭(zhēng)議，此外SIR法不適合添加了新鮮有機(jī)底物的土壤。Anderson和Domsch于1975年提出采用選擇性抑制技術(shù)分別測(cè)定土壤細(xì)菌和真菌生物量，通過(guò)添加特異性抗生素能抑制土壤中的細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)，從而可測(cè)定計(jì)算得到真菌與細(xì)菌的比率。West等1987年提出了通過(guò)測(cè)定土壤麥角甾醇含量估計(jì)土壤真菌生物量，因?yàn)辂溄晴薮际谴蠖鄶?shù)子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌類(lèi)中主要的甾醇，可作為真菌生物量的指示。但目前還發(fā)現(xiàn)沒(méi)有一個(gè)通用的轉(zhuǎn)換系數(shù)將麥角甾醇含量轉(zhuǎn)換為真菌生物量，該方法測(cè)定真菌生物量引起科研人員的質(zhì)疑，指出麥角甾醇含量只能反映土壤真菌細(xì)胞膜量。盡管如此，麥角甾醇含量仍然能在一定程度上估算土壤中真菌群落生物量。至今仍用于土壤真菌生物量的測(cè)定。1976年，Jenkinson和Powlson等最先提出了土壤微生生物量碳的熏蒸培養(yǎng)法，為土壤微生物生物量的測(cè)定找到一種較為方便的間接方法。但該方法對(duì)熏蒸滅菌、熏蒸后去除氯仿及培養(yǎng)裝置的密封性、培養(yǎng)條件和時(shí)間需要嚴(yán)格的要求，而且培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，不適宜樣品的大量分析。Brookes等在1982和1985年分別提出了更直接的估算土壤微生物生物量磷和氮的方法。經(jīng)氯仿熏蒸的土樣直接提?。囱粢惶崛》?，F(xiàn)umigation-extration，F(xiàn)E）后測(cè)定土壤微生物生物量磷和氮。1981年Sagger等采用FE法測(cè)定土壤微生物生物量硫。1987年Vance等在FE法的基礎(chǔ)上，建立了氯仿熏蒸提取-容量分析法測(cè)定土壤微生物生物量碳。之后，Wu等（1990,1993）對(duì)FE法測(cè)定土壤微生物生物量的方法進(jìn)行了改進(jìn)，又建立了氯仿熏蒸提取-儀器分析法，該方法更為快速、簡(jiǎn)便、精確，適于大量樣品的分析。SIR和FE法已成為測(cè)定土壤微生物生物量最常用的2種方法，目前這2種方法已被一些國(guó)家（如德國(guó)）權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)定為土壤常規(guī)監(jiān)測(cè)方法，形成了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（ISO142402-1:1997:E和ISO142402-2:1997:E）。國(guó)內(nèi)在土壤科學(xué)研究中，根據(jù)其目的的不同也多采用SIR和FE法對(duì)土壤微生物生物量進(jìn)行測(cè)定分析，但還尚未形成國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。4、標(biāo)準(zhǔn)編制的原則（1）本標(biāo)準(zhǔn)的編寫(xiě)依據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》和《標(biāo)準(zhǔn)化工作指南第2部分：采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)》(2)本標(biāo)準(zhǔn)的制定與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)《Soilquality-determinationofsoilmicrobialbiomass-Part1substrateinducedrespirationmetho》(ISO142402-1:1997:E)的一致性為等同的原則(3)本標(biāo)準(zhǔn)方法準(zhǔn)確可靠，能滿(mǎn)足土壤科學(xué)研究與土壤質(zhì)量監(jiān)測(cè)分析測(cè)試的要求(4)本標(biāo)準(zhǔn)方法具有普遍適用性，操作簡(jiǎn)單，耗費(fèi)低，易于推廣應(yīng)用。5、標(biāo)準(zhǔn)制定的目標(biāo)、主要技術(shù)內(nèi)容及說(shuō)明本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容包括：術(shù)語(yǔ)和定義、原理、測(cè)量條件、試劑與材料、儀器、程序、及結(jié)果計(jì)算等。方法研究的目標(biāo)(1)確定方法的適用范圍(2)轉(zhuǎn)化ISO142402-1:1997方法，形成標(biāo)準(zhǔn)文本(3)通過(guò)實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證，確定方法的可行性和適用性適用范圍等同轉(zhuǎn)化ISO142402-1:1997標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定土壤微生物生物量-底物誘導(dǎo)呼吸法的測(cè)定方法。等同轉(zhuǎn)化ISO142402-1:1997標(biāo)準(zhǔn)適用于通氣良好的農(nóng)業(yè)土壤及礦質(zhì)土壤中好氣型異養(yǎng)微生物生物量的測(cè)定，但不可用于土壤化學(xué)物質(zhì)對(duì)生物量影響的測(cè)定。術(shù)語(yǔ)和定義土壤微生物生物量土壤中所有微生物細(xì)胞的生物量。這一指標(biāo)可通過(guò)計(jì)算這些細(xì)胞中碳或氮的含量來(lái)測(cè)定，或者通過(guò)它們礦化外加碳源的能力計(jì)算。在用碳或氮含量分析時(shí)可能包括死細(xì)胞或者細(xì)胞碎片，但用呼吸法時(shí)，測(cè)量的是活細(xì)胞生物量。土壤呼吸速率一定溫度條件下，單位時(shí)間單位質(zhì)量土壤釋放出的CO2量。原理本標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)向土壤加入葡萄糖，形成系列葡萄糖含量梯度，直到達(dá)到最高呼吸速率（一般不超過(guò)1小時(shí)）。這一呼吸速率作為最大初始呼吸速率，可用于估算土壤活性生物量。測(cè)量條件本標(biāo)準(zhǔn)生物量的測(cè)定需要在恒溫（22±1℃）恒濕環(huán)境中進(jìn)行。土壤樣品含水量要求與原狀土一致。需要注意的是，土壤呼吸速率到生物量的轉(zhuǎn)化系數(shù)，其計(jì)算的溫度條件是22±1℃。試劑與材料土壤樣品土壤采樣，處理及貯存參考ISO10381-6進(jìn)行。土壤樣品的分析等效轉(zhuǎn)化ISO142402-1:1997的方法。材料粉末狀D-葡萄糖，細(xì)石英（顆粒直徑為0.1-0.5mm）或者滑石粉。儀器除常用實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，還需要以下儀器：陶瓷研缽、攪拌機(jī)、全自動(dòng)紅外氣體分析儀或氣相色譜。分析步驟等同采用ISO142402-1:1997中的分析步驟結(jié)果計(jì)算本標(biāo)準(zhǔn)中土壤微生物生物量碳（x）的測(cè)定采用以下公式：X=40R+0.37其中X是土壤微生物生物量碳，單位 g-1R是CO2的釋放速率，單位h-1kg-1式中40為轉(zhuǎn)換系數(shù)，由熏蒸-培養(yǎng)法測(cè)定的土壤呼吸速率與土壤微生物生物量關(guān)系得出。6、對(duì)實(shí)施本標(biāo)準(zhǔn)的建議《土壤微生物生物量測(cè)定-底物誘導(dǎo)呼吸法》標(biāo)準(zhǔn)操作簡(jiǎn)單，耗費(fèi)低，適用范圍廣，能夠適用我國(guó)土壤肥力監(jiān)測(cè)的要求。但土壤誘導(dǎo)呼吸量受土壤濕度影響很大，為了減少因土壤濕度對(duì)分析的影響，建議用葡萄糖水溶液代替葡萄糖粉劑，同時(shí)改變換算系數(shù)。7、參考文獻(xiàn)AndersonJ.P.E.&DomschK.H.(1975)Measurementofbacterialandfungalcontributiontorespirationofselectedagriculturalandforestsoils.Can.J.Microbiol.21:314-332.BrookesP.C.etal.(1982)Measurementofmicrobialbiomassphosphorusinsoil.SoilBiol.Biochem.14:319-329BrookesP.C.etal.(1985)Chloroformfumigationandthereleaseofsoilnitrogen:arapiddirectextractionmethodtomeasuremicrobialbiomassnitrogeninsoil.SoilBiol.Biochem.17:837-842ISO142402-1:1997(E).Soilquality-Determinationofsoilmicrobialbiomass-Part1SubstrateinducedrespirationmethodJenkinsonD.S.&PowlsonD.S.(1976)Theeffectsofbiocidaltreatmentsonmetabolisminsoil—I.Fumigationwithchloroform.SoilBiol.Biochem.8:167-177JenkinsonD.S.&PowlsonD.S.(1976)Theeffectsofbiocidaltreatmentonmetabolisminsoil-V.Amethodformeasuringsoilbiomass.SoilBiol.Biochem.8:209-213SaggerS.etal.(1981)Measurementsoilofmicrobialsulfurinsoil.SoilBiol.Biochem.13:493-498SaggerS.etal.(1981)Sulphurtransformationsinrelationtocarbonandnitrogeninincubatedsoil.SoilBiol.Biochem.13:499-511VanceE.D.etal(1987)Mi