常用分子生物學(xué)技術(shù)概述-2009

TheDepartmentofBiochemistryandMolecularBiology生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室分子生物學(xué)理論及進展Theoryandprogressofmolecularbiology常用分子生物學(xué)技術(shù)基因組與蛋白質(zhì)組基因工程基因診斷基因治療生物信息學(xué)考試課程設(shè)置（21學(xué)時）常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication石嶸shirong@操作對象：核酸蛋白質(zhì)DNARNA制備分析操作以核酸為主要對象來講述主要內(nèi)容一、常用分子生物學(xué)技術(shù)：質(zhì)粒DNA的提取基因組DNA/RNA的提取核酸的純化、分離及定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）DNA序列分析核酸雜交技術(shù)二、其他分子生物學(xué)技術(shù)：主要技術(shù)質(zhì)粒DNA提取DNA/RNA的提取純化、分離及定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）DNA合成酶切片段限制性酶切技術(shù)探針標記分子雜交技術(shù)DNA序列分析生物信息學(xué)提取DNA總的原則1保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；（pH4～10；0～4℃;機械剪力；核酸酶等）2盡量排除其他分子的污染,保證提取核酸的純度;

1)其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；2)核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；3)其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。核酸分子抽提的技術(shù)路線的設(shè)計1、核酸的釋放：

破裂細胞釋放核酸機械法與非機械法（非機械法中溶胞法是應(yīng)用最廣泛的方法）2、核酸的分離與純化：

將含有核酸分子從復(fù)雜復(fù)合物或他物質(zhì)分離中分離3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌鑒定與保存（一）核酸的鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定1、熒光光度法2、紫外分光光度法

DNAOD260/280=1.8

RNAOD260/280=2.0濃度與純度鑒定1紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。如計算DNA濃度：A260×稀釋倍數(shù)×50＝

μg/ml只用于測定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液。濃度：DNA雙鏈:1OD~50μgDNA單鏈或RNA:1OD~40μg寡核苷算單鏈:1OD~33μg純度：A260/280之比應(yīng)在1.80NanoDropND-1000spectrophotometer.2.熒光光度法NanoDrop?ND-3300Fluorospectrometer

3EB熒光分析法熒光染料溴化乙錠(EB)，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。適用于半定量分析。完整性鑒定凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場中泳動慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；總RNA電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。凝膠電泳法：BIO－RADGelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)ImageQuantRTECL凝膠成像系統(tǒng)核酸的貯存——DNA保存

1、短期貯存：4℃或-20℃存放于1×TE（tris和EDTA）緩沖液中。TE緩沖液的PH與DNA貯存有關(guān)，PH為8時，可減少DNA脫氨反應(yīng)，PH低于7.0時DNA容易變性。2、長期貯存：TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。核酸的貯存——RNA保存RnaseInhibitorRNA酶抑制劑HumanPlacentalribonucleaseinhibitor（HPRI）是一種蛋白質(zhì)，可與多種RNA酶（包括RNasesA,B,C類）非共價結(jié)合成為等摩爾復(fù)合物，抑制RNA酶活性。RNA可溶于DEPC水（焦碳酸二乙酯）中，在-70℃保存。RNA可溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可在-20℃保存。質(zhì)粒DNA的提取

PlasmidDNAPreparation分子生物學(xué)技術(shù)質(zhì)粒的基本概念質(zhì)粒提取的原理和方法質(zhì)粒的純化質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒：質(zhì)粒是染色體以外能自身獨立復(fù)制的超螺旋共價閉環(huán)雙鏈DNA分子。能自主復(fù)制，是能獨立復(fù)制的復(fù)制子。質(zhì)粒能攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達.是基因工程中廣泛應(yīng)用的基因運載工具.常見質(zhì)粒載體pUC：pUC119，pUC118，pUC18,pUC19，T—載體pBR：322，327質(zhì)

粒

結(jié)

構(gòu)

圖啟始復(fù)制子多克隆位點抗性基因標記基因質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術(shù)．1、細菌的培養(yǎng)主要步驟：2、細菌的收集與裂解3、分離純化質(zhì)粒DNA的提取和純化

質(zhì)粒DNA的小量制備2-5ml質(zhì)粒DNA的大量制備500ml堿裂解法方法煮沸法SDS裂解法Triton-溶菌酶法質(zhì)粒提取的主要方法質(zhì)粒DNA提取方法的選擇

常用的堿裂解法,煮沸法，SDS法均可獲得較滿意效果．至于有人采用堿裂解法提取小量細菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒，用煮沸法或SDS法進行質(zhì)粒DNA的大量分離，只是各個實驗室的習(xí)慣問題.質(zhì)粒提取的主要方法堿裂解法：原理：基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達到分離目的.細菌在強堿性環(huán)境中裂解，蛋白質(zhì)變性，染色體DNA被蛋白質(zhì)包裹纏繞，質(zhì)粒DNA被釋放出來。特點：操作簡單、成本低、產(chǎn)量高、純度好.質(zhì)粒提取的主要方法煮沸裂解法原理：加熱可使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性，但環(huán)狀質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)緊密而不會解鏈，溫度下降后，質(zhì)粒DNA又重新恢復(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，回收上清液中質(zhì)粒DNA。

特點：煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取小質(zhì)粒。對于會釋放出大量糖類的菌株(HB101)不適宜.質(zhì)粒提取的主要方法SDS裂解法特點：提取大質(zhì)粒（大于15kb）的首選方法，產(chǎn)量要低得多原理：將細菌懸浮在等滲的蔗糖溶液中，以溶菌酶和EDTA裂解,再酚-氯仿抽提DNA。

質(zhì)粒DNA的純化1、Sepharose4B或SephacelS-1000柱層析法2、酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）法3、聚乙二醇沉淀法4、氯化銫—溴乙錠梯度平衡超速離心法PPrO純化的目的：去除非質(zhì)粒DNA的污染物；還區(qū)分不同分子構(gòu)型基因組DNA/RNA的提取

GenomicDNA/RNAPreparation分子生物學(xué)技術(shù)DNA提取1、蛋白酶K－酚－氯仿法（酚抽提）2、甲酰胺解聚法3、試劑盒總的技術(shù)路線粗分離前處理精分離酚抽提法原理:經(jīng)消化或剪切勻漿成單個細胞的真核細胞,在蛋白酶K,SDS,RNA酶作用下,消化破裂細胞膜與核膜,Pr變性并降解成小肽或aa.DNA從核蛋白中游離,與pr分開,同時RNA酶降解污染的RNA.利用飽和酚、氯仿抽提使Pr與DNA分離，在高鹽存在下用乙醇沉淀收集DNA.應(yīng)用：DNA大小100-200Kb,可用于DNA酶切圖譜,多態(tài)性分析,基因診斷和構(gòu)建基因組文庫.DNAEXTRACTIONVIRTUALLAB/content/labs/extraction/DNA的提取DNA檢測：1、電泳檢測2、紫外分光度計檢測OD260/280=1.8Sizing,quantificationandqualitycontrolofDNA3、Agilent2100bioanalyzerRNA的提取1、異硫氰酸胍法2、Trizol3、NP40－蛋白酶K法4、鹽酸胍法方法的選擇：根據(jù)組織的情況以及各方法的優(yōu)點進行選擇。一定要注意防RNA酶的污染RNA提取的主要方法一步法特點：簡便、快捷，RNA的完整性和純度高原理：以（異）硫氰酸胍和

-巰基乙醇為裂解液裂解細胞，PH在4.0的條件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌改進：以（異）硫氰酸胍-酚為裂解液，再加入氯仿形成兩相，變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相之間，上層是RNA溶液。最后通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌RNA質(zhì)量檢測：1、電泳（28S：18S＝2：1）2、紫外分光度計檢測OD260/280＝2.0＞1.8

3、Agilent2100bioanalyzerIndustrystandardofRNAqualitycontrolmRNA的分離原理：以總RNA為起始材料，利用核酸的堿基配對原理，通過寡聚（dT）纖維素或者寡聚（U）瓊脂糖親合層析從大量的RNA中分離mRNA。方法：（1）oligo(dT)-纖維素層析柱法（2）oligo(dT)-纖維素液相結(jié)合離心法（3）磁珠分離法oligo(dT)-纖維素層析柱法磁珠分離法核酸的分離純化方法電泳技術(shù)是分離，鑒定和純化DNA片段的首選標準方法分類：瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳脈沖場凝膠電泳非變性PAGE變性PAGE倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳錯位均勻電場電泳核酸的分離純化方法

瓊脂糖凝膠電泳:分離0.5~25kb的DNA片段非變性PAGE：小的雙鏈DNA，分辨率高達1bp

變性PAGE：單鏈DNA片段，分辨1bp以上倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳：分離10~2000kb的DNA分子錯位均勻電場電泳:可分離幾百萬堿基對的DNA分子DNA片段的回收主要方法：（1）低熔點瓊脂糖挖塊法（2）玻璃棉離心法（3）透析袋脫洗（4）凍融法（5）膠的壓碎浸泡法聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction分子生物學(xué)技術(shù)1985年，Mullis創(chuàng)建了聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，簡稱PCR技術(shù)。(1993年諾貝爾獎）這是一種在體外由引物介導(dǎo)的DNA序列酶促合成反應(yīng)，可以增加靶基因的拷貝數(shù)達百萬倍，極大的提高了檢測靈敏度。PCR技術(shù)簡介PCR起源PCR技術(shù)的七種基本成份PCR技術(shù)引物設(shè)計的原則PCR的基本反應(yīng)步驟PCR的主要用途幾種重要的PCR衍生技術(shù)一、PCR技術(shù)的起源PCR方法始于20世紀70年代初，由Khorana(1968)與他的同事提出，作為一種降低化學(xué)合成基因工作量的策略1985年，KaryMullis及其同事報道用大腸桿菌DNA聚合酶I片段體外擴增單拷貝基因1988年，耐熱穩(wěn)定DNA聚合酶的應(yīng)用使PCR技術(shù)得以廣泛應(yīng)用PCR技術(shù)對靶基因擴增的工作原理二、PCR體系基本組成成分模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

一價陽離子K+維持PH值的緩沖液熱穩(wěn)定DNA聚合酶來源：嗜熱和高度嗜熱的真細菌，其聚合酶類似于常用的DNA聚合酶Ⅰ可供選擇的種類很多，主要合成大片段DNA產(chǎn)物需要的保真度、效率及合成能力而決定常規(guī)PCR，TaqDNA聚合酶最為常用。嗜熱水生菌(Thermusaquaticus)反應(yīng)體系里的其它幾種成分二價陽離子Mg2+：DNA聚合酶都要求有游離的二價陽離子，通常是Mg2+維持pH值的緩沖液：調(diào)至8.3～8.8之間，72℃溫育后，pH值下降至7.2左右一價陽離子：Kcl對于擴增大于500bp的DNA片段是有益的。提高KCl的濃度對于短片段的DNA擴增有利模板DNA：線性DNA模板擴增效率較高，高分子量DNA為模板時，先用內(nèi)切酶消化，效果更佳質(zhì)粒DNA10ng，基因組100ng左右三、PCR技術(shù)引物設(shè)計如何來設(shè)計引物？如何來擴增我們的目的基因？首先嘗試在起始密碼子前，終止密碼子后設(shè)計引物，以獲得含完整編碼序列的基因或cDNA.但許多基因編碼序列的兩端不具保守性，或兩端雖具有保守序列但不適宜設(shè)計為PCR引物?？蓮幕騼?nèi)部來尋找保守序列，并設(shè)計引物。通過PCR擴增出基因的部分序列，再以次序列作為探針篩選基因組文庫或cDNA文庫，或利用PCR技術(shù)獲得完整基因和全長cDNA.PCR技術(shù)引物設(shè)計的原則引物與模板的序列要特異性的互補長度：一般為20-27bpG+C含量：一般為40%-60%引物不能在模板的非目的引發(fā)DNA聚合反應(yīng)，即錯配3’3’5’5’5’5’引導(dǎo)DNA合成的寡核苷酸引物5’ACTGCGTGCACGTGGGGTCCCAGGG3’hairpindimerCrossdimer設(shè)計原則例：

His-Phe-Pro-Phe-Met-Lys5’-CAYTTYCCNTTYATGAARY=PyrimidineN=anybaseR=purine簡并引物:常用的引物設(shè)計軟件Primerpremier(Windows,Dos,PowerMac)Oligo4.0,Oligo5.0,Oligo6.24Lasergene(Dos,Windows,Macintosh)DNAtoolsVectorNTⅠPrimer3(/primer3/)四、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C退火Tm-5?C延伸72?C（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析五、PCR的主要用途六、幾種重要的PCR衍生技術(shù)多重PCR巢式PCR（NP-PCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（RT－PCR）反向PCR技術(shù)定量PCR技術(shù)實時PCR技術(shù)(real–timePCR）原位PCR（insituPCR）反轉(zhuǎn)錄PCR

（ReversetranscriptionPCRRT-PCT)反轉(zhuǎn)錄PCR：mRNAcDNAPCR抽提RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNAPCR擴增RT-PCR原位PCR：是指直接用細胞涂片或石蠟片包埋組織切片在單個細胞中進行PCR擴增，然后用特異探針進行原位雜交檢測含該特異序列的細胞的一種方法。原位PCR（insituPCR）用限制性內(nèi)切酶消化DNA片段，然后用連接酶將酶切產(chǎn)物連接成環(huán)狀，再用已知序列上兩端相反方向的引物進行PCR。

反向PCR技術(shù)(InversePCR)錨定PCR(anchoredPCR)錨定PCR：錨定主要用于擴增未知序列或未全知的序列。首先分離總RNA或mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA的3′端上加上poly(dG)尾，與此poly(dG)相對應(yīng)的錨定引物為poly(dC)，為保證擴增特異性，poly(dC)應(yīng)在十二聚以上，5′端還可帶上某些限制性酶序列或其他序列信息。巢式PCR（nestedPCR,N-PCR）巢式PCR有兩對引物，一對引物對應(yīng)的序列在模板外測，稱外引物，另一對引物互補序列在同一模板的外引物的內(nèi)側(cè)，稱內(nèi)引物，即外引物擴增產(chǎn)物較長，含有內(nèi)引物擴增的靶序列，經(jīng)過二次PCR放大將單拷貝的目的DNA序列檢出。巢式PCR最大的優(yōu)點是靈敏度大大提高不對稱PCR（asymmetricPCR）可以產(chǎn)生一個單鏈DNA(ssDNA)。這種ssDNA產(chǎn)物可以進行一系列研究，如DNA序列分析等。熒光實時定量PCR

(FluorescenceQuantifiedrealtime–PCR)實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。

實時熒光定量PCR原理

所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

1）SYBR熒光染料

(非特異性嵌入熒光染料)在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料；SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。2）TaqMan熒光探針：特異性熒光探針：熒光基團、淬滅熒光基團

PCR擴增：Taq酶的5’－3’外切酶活性兩基團分離，熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步TaqMan熒光探針工作原理

非特異性嵌入熒光染料

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis分子生物學(xué)技術(shù)

FredSanger發(fā)明的Sanger測序法，WalterGilbert發(fā)明的Maxam-Gillbert法.給DNA的測序帶來了一場革命。分享了1980年的諾貝爾化學(xué)獎。后來Sanger法發(fā)展為自動化測序法，并為人類基因組測序做出了卓越貢獻。核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強度，使一個斷裂點僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。二、DNA鏈末端合成終止法二、DNA鏈末端合成終止法二、DNA鏈末端合成終止法三、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。DNA自動測序結(jié)果舉例分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&BlottingTechnology分子生物學(xué)技術(shù)核酸分子雜交：在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。雜交的類型：液相雜交：固相雜交：膜固相印記雜交、組織細胞原位雜交、菌落原位雜交一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。

探針(probe)

一小段用同位素、生物素或熒光染料標標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（一）印跡技術(shù)：將在凝膠中分離的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）或直接放在固定化介質(zhì)上并加以監(jiān)測分析的技術(shù)（二）探針技術(shù)：探針的類型

核酸分子探針是指用放射性核素或其他標記物標記的、能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用的DNA或RNA片段。1．基因組DNA探針：病毒DNA等2．cDNA探針；最常用3．寡核苷酸探針：10-50bp，測序、點突變4．RNA探針：特異性強，但RNA極易降解，不宜操作。5.肽核酸探針探針的標記物理想的標記物：敏感度高；特異性強；不影響探針分子的主要理化特性；標記、檢測方法簡單、探針保存時間長；對環(huán)境無污染、對人體無損害；價格低廉。一）放射性標記物二）非放射性標記物（一）

放射性標記物

放射性核素利用放射性核素能產(chǎn)生射線的特性將核素標記在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通過一定方法摻入到DNA或RNA中去制成探針，與待測的核酸雜交后，核素產(chǎn)生的或射線可使底片感光的特性，通過放射自顯影的方法進行檢測。產(chǎn)生射線的核素：32P、3H、35S產(chǎn)生射線的核素：125I1、常用的放射性核素

1）

32P：產(chǎn)生

射線，靈敏度高，分辨率強，是最常用的放射性標記物，但半衰期短（14.3天）：位和位標記。2）35S：分辨率高、半衰期長（87.1天）敏感度低

35S35S35S2、放射性標記物的優(yōu)缺點優(yōu)點：靈敏度高：0.01pg特異性強缺點：放射性污染成本高、半衰期短，不能長期保存（二）非放射性標記物1、優(yōu)缺點優(yōu)點：無放射性污染成本低、操作簡單缺點：敏感性、特異性均低于放射性核素核酸探針的標記方法(1)放射性同位素標記：３２Ｐ、3H、35S等

切口平移法(nick-translation)隨機引物法RNA探針體外轉(zhuǎn)錄法末端標記法(2)非放射性標記：

化學(xué)標記法:生物素，Cy3，Cy5，地高辛等酶標法:2、常用的標記物生物素：1-2pg生物素化核苷酸：bio-16-dUTPbio-11-dUTP生物素化核苷酸通過酶觸反應(yīng)摻入到DNA中去制成探針雜交抗生物素蛋白-生物素-酶的復(fù)合物—加底物—顯色光敏生物素：生物素與光敏基團結(jié)合光敏生物素光敏生物素與核酸探針混合在強光的作用下光敏基團與核酸共價結(jié)合生物素標記的探針（一）切口平移法

（nicktranslation）

當雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。切口平移法的特點1）快速、簡便、標記的探針均一、特異性高2）僅適用于較長的雙連DNA3）DNA多聚酶必須是E.ColiDNA多聚酶的全酶4）DNA酶I的濃度一定要適宜（二）隨機引物法

（randompriming)

隨機寡核苷酸引物（randomprimer)：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物，可以與任意核苷酸序列雜交，起到聚合酶反應(yīng)引物的作用E.coliDNA聚合酶I的Klenow大片段（僅具有5-3多聚酶的活性，而無外切酶的活性）隨機引物法的特點1）不但可用于雙連DNA的標記，而且

可用于單連DNA和RNA的標記2）操作簡單3）標記率高（三）末端標記法(1)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶法（terminaldeoxynucleotidetransferase)5’——DNA——3’OH+-32p-dNTP5’_______DNA______3’(pdN)n+nPPi

(焦磷酸）末端轉(zhuǎn)移酶（三）末端標記法（2）T多核苷酸激酶法（methodofT4polynucleotidekinase)3’——————5’OH+32P-P-PA(ATP）————————5’32P+PPAT4多核苷酸激酶標記后處理根據(jù)需要進行純化1、去除dNTP或NTP2、蛋白質(zhì)3、小片段4、標記緩沖液成份膜固相印記雜交（一）固相支持物的選擇１、硝酸纖維素膜：在高離子強度下，具有較強的吸附單鏈DNA和RNA的能力：80-100μg/cm2２、尼龍膜：在低離子強度下，很強的吸附單鏈、雙鏈的DNA或RNA；350-500μg/cm2雜交的基本過程：變性

雜交

洗膜

雜交信號的檢測１、變