實時定量PCR課件

1實時定量PCR

QuantitativeReal-TimePCR梁沛中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系2主要內(nèi)容基本原理幾個概念絕對定量相對定量常見問題3一、基本原理4發(fā)展簡史1993年，日本Higuchi等人首次采用動態(tài)PCR的方法和封閉式檢測方式對目的核酸數(shù)量進行定量分析，首次提出了熒光定量PCR技術(shù)的概念。

熒光染料：EB（溴乙錠）

PCR儀：改良的熱循環(huán)儀激發(fā)光：UV射線檢測器：CCD相機缺點：儀器耗費巨大；非特異產(chǎn)物導(dǎo)致定量不準確5發(fā)展簡史1995年美國PE公司成功開發(fā)TaqMan技術(shù)1996年推出了首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)優(yōu)點：操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等6實時定量PCR的概念實時定量PCR技術(shù)（real-timequantitativePCR）

是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，實時監(jiān)測整個PCR過程中熒光信號的累積強度，并利用特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進行定量分析的方法。RT-PCR：Reverse-transcriptionPCRqRT-PCR:quantitativeReal-timePCR78ABI7300熒光定量PCR儀ABI：Applied

Biosystems

Inc.9檢測通道2004年推出的7300和7500均為第三代產(chǎn)品，2001推出的7900為第二代產(chǎn)品。7300：4通道7500：5通道均需加Rox染料進行校正1011兩種熒光標記法1.染料染色

-SYBRGreenI

-EB2.探針標記

-Taqman

-TaqmanMGB

-分子信標12

SYBRGreenI的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm1.熒光染料法13化學(xué)原理14染料法的優(yōu)缺點優(yōu)點：實驗設(shè)計簡單，僅需要設(shè)計一對上下游引物，不需要設(shè)計探針，通用性好；成本低；可通過溶解曲線分析檢驗擴增產(chǎn)物的特異性。低通量實驗一般優(yōu)先考慮使用SYBRGreenI染料法。15染料法的優(yōu)缺點缺點SYBRGreenI方法對PCR擴增特異性要求較高

SYBRGreenI可與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性SYBRGreenI不能區(qū)分不同擴增片段發(fā)出的熒光而導(dǎo)致它不能用于多重反應(yīng)

162.熒光探針法(Taqman)17TaqmanProbeQuencherReporter18Tagmanprobe的工作原理19探針與PCR產(chǎn)物的數(shù)量關(guān)系每產(chǎn)生一個新的DNA片段，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個單位的熒光信號信號強度與DNA的copy數(shù)成正比20探針法的優(yōu)缺點優(yōu)點：Tagman探針法中，除引物外，還使用了一條特異的探針，因此此方法可以特異的檢測目標序列，防止非特異產(chǎn)物的干擾影響定量的準確性可用于多重反應(yīng)，即可同時檢測多個目的基因。缺點：但探針設(shè)計成本較高，有時探針設(shè)計困難。21二、幾個概念221.擴增曲線描述PCR動態(tài)進程的曲線稱為擴增曲線。PCR的擴增曲線實際上并不是一條標準的指數(shù)曲線，而是呈S型曲線CyclesFluoresces231.擴增曲線擴增曲線分三個階段：熒光背景信號階段(基線期)：擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。熒光信號指數(shù)擴增階段（對數(shù)期），PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可選擇該階段進行定量分析。在平臺期：擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。242.熒光閾值一般把熒光PCR的前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline，基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。是人為設(shè)定的一個值，可設(shè)在指數(shù)擴增階段任意位置上。缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍（自動）。2.熒光閾值25262.熒光閾值手動設(shè)置，原則：大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，真正的信號是超過域值的熒光信號。273.

Ct值Cyclethreshold，就是當擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)。線性圖譜半對數(shù)圖譜Ct值Ct值28Ct值的重現(xiàn)性293.

Ct值Ct值與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，達到閾值所需的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的Ct值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。3031Ct值定量的數(shù)學(xué)原理×32Ct值定量的數(shù)學(xué)原理×33Ct值定量的數(shù)學(xué)原理34Ct值定量的數(shù)學(xué)原理Threshold10410310235靶標基因的定量36靶標基因的定量50001000012需要制備標準品需制作絕對標準曲線無需標準品，需制作相對標準曲線37靶標基因的定量CYP6B6ActinNorthernblot半定量PCR38三、絕對定量39三、絕對定量40三、絕對定量標準品的一些標準：必需用與擴增目的基因相同的引物進行擴增，并且擴增效率相同標準品必需是經(jīng)過準確定量的（例如，用分光光度計定量）標準品必需是標準化的（例如，同一化的細胞數(shù)）在每組實驗時，標準品和待測樣品必需用相同的閾值來確定Ct值41三、絕對定量標準品的制備方法：1.化學(xué)合成目的基因，優(yōu)點是純度高、定量準確

缺點是受化學(xué)合成工藝限制，只能合成120bp以下的長度；2.回收純化PCR產(chǎn)物后克隆到載體上，然后抽提質(zhì)粒，經(jīng)過測量濃度和拷貝數(shù)的換算，可準確定量

優(yōu)點是穩(wěn)定、準確。42三、絕對定量標準品倍比梯度稀釋方法：10v原液(標準品i)+90v稀釋緩沖液，得標準品ii10v標準品ii+90v稀釋緩沖液，得標準品iii10v標準品iii+90v稀釋緩沖液，得標準品iv10v標準品iv+90v稀釋緩沖液，得標準品v

Why?43三、絕對定量拷貝數(shù)的計算(以dsDNA為例）待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×50×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×660dalton/bp待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本質(zhì)量/樣本分子量×6×101444三、絕對定量拷貝數(shù)的計算舉例：3000堿基質(zhì)粒，濃度100ng/ulMW=3000bpx660dalton/bp=1.98x106daltons。copy數(shù)＝--------------×6×1014

＝3x1010copies/ul100ng1.98x10645絕對定量舉例Copies/ulCt1Ct2MeantCtSTD5×10328.1828.6428.410.165×10425.2525.1425.190.045×10522.1122.4622.280.125×10618.6318.9218.770.10Blank－－棉鈴蟲Cyp6B2基因拷貝數(shù)檢測46絕對定量舉例擴增效率（E）計算E=10-1/斜率

=10-1/-3.18=2.06E%=(2.06-1)×100%=106%47絕對定量舉例如未知樣本Ct為20.5，將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.183X+40.211X=（20.5-40.211）/-3.183=6.19未知樣本拷貝數(shù)=106.19

=1548816copies/ul48四、相對定量無需知道目的基因的絕對拷貝數(shù)需要注意的問題：

1.模板均一性問題：起始的細胞數(shù)、細胞的狀態(tài)、均一性等

2.RNA制備：RNA純化得率、均一性等

3.反轉(zhuǎn)錄：反轉(zhuǎn)錄的效率等49內(nèi)標/內(nèi)參照因RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度可能不同。因此，在進行基因表達研究中都會用看家基因（house-keepinggene）對數(shù)據(jù)進行標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有：GAPDH、Beta-actin、18SrRNA等50相對定量的方法雙標準曲線法△△Ct法51雙標準曲線法優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化簡單。缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標準曲線；必需有固定的標準品做標準曲線；這些標準品并不代表樣品擴增的真實狀態(tài)比如標準品為質(zhì)?；蚣兓腜CR產(chǎn)物，而待測樣品為cDNA，那么標準曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況。應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一。處理組目的基因表達量處理組參照基因表達量對照組目的基因表達量對照組參照基因表達量相對表達量＝52△△Ct法△Ct，即Ct的變化值假定目的基因和參照基因的擴增效率相同，均為100%＝2-(△Ct1-△Ct2)＝2-△△Ct53△△Ct法－舉例Cyp6B6aveCt18SRNAaveCt標準化的Cyp6B6△Ct校正△△Ct處理組22.812.310.5-1.4對照組24.512.611.90因此，處理組Cyp6B6基因的表達量是對照組的2-△△Ct=2-（-1.4）＝21.4＝2.64倍54△△Ct法優(yōu)點：優(yōu)化的體系建立后，每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標準曲線，而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可。要求：標準曲線斜率差值<0.1缺點：假定擴增效率為100%；假定標準曲線及每次擴增之間的效率都保持一致；實驗條