中藥顯微鑒別技術講義3

第三部分顯微制片技術

在進行顯微鑒別時，首先要將“檢樣”制成適于鏡檢的標本。對于完整的藥材可制成各種切面的切片；對于粉末藥材(包括丸、散等成方)可直接裝片或作適當處理后制片。

永久片制作技術臨時制片技術1、制片設備

滑走切片機——半自動切片機脫水機

包埋機2變倍體視顯微鏡是一種具有立體感覺的顯微鏡。主要用途：

作為動物學、植物學、昆蟲學、組織學、礦物學、考古學、地質(zhì)學和皮膚病學等的研究和解剖工具。電腦型連續(xù)變倍體視顯微鏡SZX-16研究用電腦（數(shù)碼相機）型連續(xù)變倍體視顯微鏡它觀察物體時能產(chǎn)生正立的三維空間像，立體感強，成像清晰和寬闊，具有較長的工作距離，，并可根據(jù)觀察物的特點選用不同的反射和透射光照明，是適用范圍非常廣泛的常規(guī)顯微鏡。對同一物體可實現(xiàn)連續(xù)放大倍率觀看,可能直接電視機或電腦上觀察實物圖像。目鏡鏡臂物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡玻片移動裝置載物臺聚光鏡光源鏡座3、透射光生物學顯微鏡數(shù)碼型透射光生物學顯微鏡123456784、偏光顯微鏡偏光顯微鏡偏光顯微鏡(polarizingmicroscope)

用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。和普通顯微鏡不同的是：其光源前有偏振片（起偏振器），使進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中裝有另一偏振片（檢偏振器，一個偏振方向與起偏振器垂直的起偏器），這種顯微鏡的載物臺是可以旋轉(zhuǎn)的，當載物臺上放入單折射的物質(zhì)時，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時，由于光線通過這類物質(zhì)時發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺便能檢測到這種物體。在偏光顯微鏡下，藥材的鑒別要素在色彩上表現(xiàn)出一定的變化，可作為大多數(shù)植物、動物、礦物類藥材的顯微鑒別依據(jù)之一。如植物的淀粉在偏光顯微鏡下呈現(xiàn)黑十字現(xiàn)象，不同類型的淀粉其黑十字形象不同（圖2）；草酸鈣結晶類型多樣，在偏光顯微鏡下呈不同的多彩顏色（圖2）；石細胞在植物體內(nèi)廣泛分布，其細胞壁在偏光顯微鏡下呈亮黃色或亮橙黃色；纖維、導管在偏光顯微鏡下則呈強弱不同的色彩；動物的骨碎片、肌纖維、結晶狀物、毛茸等也呈現(xiàn)出不同的偏光特性；礦物類物質(zhì)多具有偏光特性。偏光下的草酸鈣晶體與淀粉粒5、倒置生物學顯微鏡6、掃描電子顯微鏡掃描電鏡工作原理掃描電子顯微鏡（簡稱掃描電鏡）分辨率高，放大倍率5~100,000，能使物質(zhì)的圖像呈現(xiàn)顯著的表面立體結構特征，樣品制備操作又較簡易。在藥材鑒定，特別在同科屬種間的表面結構的鑒別比較上，已成為一種新的手段。如：掃描電子顯微鏡用于研究花粉粒、種皮和果皮的表面紋飾，莖、葉表皮組織的結構(毛茸、腺體、氣孔、角質(zhì)層、蠟層、分泌物等)的細微特征，木類藥材的解剖以及動物體壁、鱗片及毛等的鑒別。

小孢子囊及小孢子微形態(tài)差異十三種卷柏大孢子微形態(tài)差異使用顯微鏡的注意事項合理制片，蓋玻片上不得有試液殘留，避免污染物鏡及載物臺，損傷鏡頭。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，由低到高逐級變換、選用合適放大倍數(shù)的物鏡觀察。使用40倍物鏡時，可用細螺旋調(diào)節(jié)焦距，禁止用粗螺旋調(diào)節(jié)；也不得移動載玻片。根據(jù)觀察物象，選擇偏光條件確認特征。用畢，應將最小物鏡與通光孔相對，關閉光源，罩好，收置起來。顯微鏡的光學部分，只能用特殊的擦鏡頭紙擦拭。7、常用制片法

——永久片制作技術藥材切片標本的制作方法較多。在藥材鑒定的研究工作中往往將其制成石蠟切片(永久切片)，因制成的石蠟切片外形較完整，厚薄均勻，且可制得連續(xù)切片，觀察時方便，又能長期保存。但由于制片技術較復雜，費時太多，不適用于日常檢驗。常用制片法

——臨時制片技術徒手切片或滑走切片法：表面裝片：為觀察葉類、花類及全草類藥材的葉片、花冠、萼片、苞片等的表皮組織及其附屬物的特征。解離組織裝片：可清楚地觀察比較堅硬的細胞組織，如導管、纖維、石細胞等的形態(tài)?；ǚ哿Ｅc孢子制片法：觀察花粉粒、孢子等的形態(tài)特征或構造，需用花粉粒與孢子制片法制片。磨片法：觀察礦物藥或較堅硬的動物類藥材如珍珠、石決明及動物骨骼，可采用磨片法制片。7.1

儀器和用具

儀器

生物學顯微鏡（最好具有2.5×或4×物鏡頭及偏光裝置）、顯微攝影裝置或顯微描繪器、電腦聯(lián)機裝置及其圖像處理軟件、滑走切片機、小型粉碎機、臺式離心機、醫(yī)用超聲儀等。

用具

放大鏡、刀片、鑷子、剪刀、解剖針

載玻片、蓋玻片7.1儀器和用具吸濕器（即玻璃干燥器改裝成底部放入蒸餾水加微量苯酚防霉，上部瓷板上置藥材樣品，利用潮氣潤濕藥材樣品）培養(yǎng)皿或小燒杯、酒精燈、試管，試管架、滴管、玻璃棒、乳缽、綢布、濾紙、火柴等。7.2試液——封藏劑7.2.l

水合氯醛試液為常用封藏液，也是透化劑。可使干縮的細胞膨脹而透明，并能溶解淀粉粒、樹脂、蛋白質(zhì)、葉綠素及揮發(fā)油等，加熱后更為明顯。

7.2.2

甘油醋酸試液（斯氏液）為常用封藏液，專用于觀察淀粉形態(tài)，可使淀粉粒保持原形，便于測量其大小。

7.2.3

甘油-乙醇溶液封藏液，也是軟化劑。常用于保存植物性材料及臨時切片，有軟化組織的作用。3試液——染色劑7.2.4

蘇丹Ⅲ試液此液可使木栓化、角質(zhì)化細胞壁及脂肪油、揮發(fā)油、樹脂等染成紅色或淡紅色。

7.2.5

釕紅試液（臨用新制）此液可使粘液染成紅色。

7.2.6

間苯三酚試液此液與濃鹽酸合用，可使木化細胞壁染成紅色或紫紅色。

7.2.7

碘試液（臨用現(xiàn)配。應置棕色瓶內(nèi)保存）此液可使淀粉染成藍色或紫色；蛋白質(zhì)或糊粉粒染成棕色或黃棕色。

7.2.8硝鉻酸試液此液為常用的“植物組織解離液”。各檢品的解離浸泡時間，按材料的質(zhì)地不同而異。7.2.9α-萘酚試液此液可使菊糖染成紫紅色，并很快溶解。

3.1l氯化鋅碘試液此液用于檢查木質(zhì)化與纖維素細胞壁，前者顯黃棕色，后者顯藍色或紫色。7.3

顯微標本的制作7.3.1

橫切制片或縱切制片

7.3.1.1

藥材的預處理將應觀察的部位、切成適當大小的塊或段，一般以寬lcm、長3cm為宜，切面削平整。質(zhì)地軟硬適中的樣品可直接進行切片；質(zhì)地堅硬的則需先使其軟化后再切片。制片的預處理——軟化軟化方法可采用放在吸濕器中悶潤，或在水中浸軟或煮軟。經(jīng)軟化處理的材料，檢查軟化是否合適，可用刀片切割材料，若較容易切下薄片，則表示軟化適宜。有些根、根莖、莖及木類藥材，質(zhì)地較堅實，可將削平的切面浸水中片刻，待表面潤濕時取出，直接切片也能切成較完整的薄片。過于柔軟的樣品，可將其浸入70%~95%乙醇中，約20分鐘后可變硬些，再切片。制片的預處理——禁忌藥材預處理時，應注意不能影響要觀察的顯微鑒別特征。如要觀察菊糖、粘液等在軟化、切片、裝片等過程中，均不可與水接觸，以免溶解消失；要觀察揮發(fā)油、樹脂等，則不可與高濃度乙醇或其它有機溶媒接觸。如：茯苓淀粉粒菊糖7.3.1.2切片在檢驗工作中，此法最常用，操作簡便，迅速，制成的切片保持其細胞內(nèi)含物的固有形態(tài)，便于進行各種顯微化學反應觀察1)

徒手切片法切片一手持刀片，另一手拇指和食指夾持樣品，中指托著樣品的底部，使樣品略高出食、拇二指；肘關節(jié)應固定，使樣品的切面保持水平，刀口向內(nèi)并使刀刃自前向后切削，即可得薄切片。操作時，材料的切面和刀刃須經(jīng)常加水或50%乙醇保持濕潤，防止切片粘在刀片上。切好的切片用毛筆蘸水輕輕從刀片上推入盛有水或50％乙醇的培養(yǎng)皿中。2)滑走切片機切片此法不需要較高的技巧，只要了解掌握操作方法，短時間內(nèi)即可學會并切出較薄的切片，適用于切質(zhì)地堅實、形狀較大的藥材樣品，柔軟的樣品經(jīng)冷凍處理亦可切得較薄的切片。

切片前：應檢查切片機是否穩(wěn)固，并調(diào)試刀具。將切片刀夾持在夾刀器上夾緊，調(diào)整刀的角度(約0。~15。)；調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器至所需厚度。把制備好的樣品用兩塊軟木夾住或直接放在切片機的材料固定器上夾緊夾正，使樣品露出軟木塊或固定器上端0.5cm，調(diào)整好樣品高度，使刀刃靠近樣品的切面且平行并略高于刀刃約0.5~1mm。切片時

用右手握夾刀器柄，往操作者方向迅速拉動，切下的切片附著于刀的表面上，用毛筆蘸水把切片取下放于盛水的培養(yǎng)皿中。將刀推回原處，轉(zhuǎn)動厚度推進器，用毛筆蘸水潤濕材料切面及刀刃，再拉刀柄，往返推拉，可得到許多厚度均勻完整的切片。若切片不成功，應檢查切片刀是否太鈍，則應磨刀或換鋒銳的切片刀，若切得太薄而破碎，則逐漸增加厚度至能切得完整的薄片為度。注意：夾持在材料固定器上的樣品切面接近于固定器上端時，必須注意防止切片刀刃碰撞固定器而損毀切片刀。7.3.1.3

裝片選取薄而平整的切片置載玻片上，根據(jù)所要觀察的內(nèi)容要求，滴加適宜的試液1~2滴，蓋好蓋玻片，即可在顯微鏡下觀察。為防止較大的切片彎卷，可選取理想的切片，用兩張載玻片夾住，浸于水中放置4小時使材料壓平，放入95%乙醇中固定，甘油裝片觀察。透化在載玻片上放有切片處滴加1~2滴水合氯醛試液，置載玻片于酒精燈上方微微加熱，至邊緣起小泡即停止加熱，可繼續(xù)補充試液再加熱，以不燒干為度，直至切片透化完全為止。注意：加熱溫度不能過高，以防水合氯醛試液沸騰，使組織內(nèi)帶入氣泡；加熱時應將載玻片不斷移動，以免受熱不勻而炸裂。透化后放冷，加甘油乙醇試液l~2滴后加封蓋片，貼上標簽。冬日室溫較低時，透化后不待放冷即滴加甘油乙醇液，以防水合氯醛結晶析出而妨礙觀察。水合氯醛試液能使已收縮的細胞膨脹，便于清楚地觀察組織構造；可溶解淀粉粒、蛋白質(zhì)、葉綠體、樹脂、揮發(fā)油等，對草酸鈣結晶無作用，為觀察草酸鈣結晶的良好試劑。如需觀察菊糖等一些多糖物質(zhì)則加水合氯醛試液不加熱。7.3.2

粉末制片主要用于粉末狀的藥材及藥材粉末制成的成方制劑的觀察。

4.2.l藥材粉末制備取干燥藥材，磨或銼成細粉（通常應過80目以上藥篩），裝瓶，貼上標簽。制備粉末時，注意取樣的代表性。例如：根類藥材要切取根頭、根中段及根尾等部位，并全部磨粉，過4號篩，混合均勻，不得丟棄渣頭。干燥時，一般溫度不能超過60℃，避免淀粉粒糊化，有礙觀察。7.2.2

粉末制片用解剖針挑取樣品粉末少許，置載玻片的中央，加適宜的試液1滴，用針攪勻(如為酸或堿時應用細玻棒代替針)，待液體滲入粉末后，用左手食指與拇指夾持蓋玻片的邊緣，使其左側與藥液層左側接觸，再用右手持小鑷子或解剖針托住蓋玻片的右側，輕輕下放，則液體逐漸擴延充滿蓋玻片下方。如液體未充滿蓋玻片，應從空隙相對邊緣滴加液體，以防產(chǎn)生氣泡；若液體過多，用濾紙片吸去溢出的液體，最后在載玻片的左端貼上標簽或書寫上標記。7.3.3顯微化學分析

丁香切片滴加3%氫氧化鈉的氯化鈉飽和液，油室內(nèi)有針狀丁香酚鈉結晶析出；北柴胡橫切片加無水乙醇-濃硫酸1：1液，木栓層、栓內(nèi)層和皮層顯黃綠色至藍綠色。7.3.4微量升華法

利用藥材所含成分有升華現(xiàn)象，置顯微鏡下觀察結晶形狀、色澤。如大黃，可見菱狀針狀或羽狀結晶。7.3.5

成方制劑粉末裝片

按劑型不同，分別處理樣品，按粉末制片法裝片觀察。1)散劑、膠囊劑可直接取出粉末（內(nèi)容物為顆粒狀的應研細）裝片，或透化裝片。2)

片劑可取2~3片，水丸、糊丸、水蜜丸、錠劑等（有包衣者除去包衣）取數(shù)丸或1~2錠，置于乳缽中研細，取出適量粉末裝片，或透化裝片。

3)

蜜丸劑樣品可用兩種方法處理：(1)用解剖刀沿蜜丸正中切開，從切面由外至內(nèi)刮取少許樣品，置載玻片中央，滴加適宜的試液，用玻璃棒攪勻。按上述粉末制片法裝片，或透化裝片。(2)將樣品切碎放入容器，加水攪拌洗滌，然后