抗原抗體反應的應用免疫學導論

抗原抗體反應的應用免疫學導論免疫沉淀和免疫凝集

免疫沉淀和免疫凝集利用抗原與抗體特異性反應的特性對抗原或抗體進行量或質(zhì)的測定分析是最經(jīng)典的血清學方法。溶液中的沉淀反應在體外，當抗體與相應抗原二者濃度比例適當時，會發(fā)生免疫沉淀反應，可用于抗原或抗體的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于判斷，即環(huán)狀沉淀試驗。環(huán)狀沉淀試驗原理將抗原溶液疊加在細小玻璃管中抗體溶液上面，抗原與抗體在兩液交界面處特異性結合，形成白色沉淀環(huán)

?！驹u價】：簡便快速只能定性敏感性低凝膠中沉淀反應抗原分子和抗體分子在凝膠介質(zhì)中自由擴散形成梯度濃度，抗原與抗體在比例合適的一定擴散部位相遇形成沉淀線?？捎糜跍y定抗原與抗體的相對濃度，也可用于比較不同抗原的特異性、純度及相互關系。主要有兩種方法：單向免疫擴散、雙向免疫擴散單向免疫擴散基本原理

待測抗原從局部含有相應定量抗體的凝膠內(nèi)自由向周圍擴散，抗原抗體特異性結合，在二者比例合適的部位，形成白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原的濃度成正相關。

方法：將適當濃度的抗體混于瓊脂（0.8%~1%）中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔開始向周圍擴散，并在小孔周圍合適的位置形成沉淀。沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相關。單向免疫擴散?影響因素1.抗原分子量：與擴散速度、沉淀環(huán)反相關

2.抗體種類：兔抗血清優(yōu)于馬、羊

3.抗體稀釋度：抗體濃度大沉淀環(huán)小

4.擴散時間：抗原含量高，擴散時間長

5.擴散溫度：4～37℃內(nèi)溫度與擴散速度正相關6.瓊脂板厚度：與沉淀環(huán)反相關雙向免疫擴散【原理】：將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴散，當抗原與抗體相遇，在比例合適時形成沉淀線。染色標本圖1.抗原抗體雙向自由擴散2.24小時出結果3.呈現(xiàn)沉淀線或弧模擬圖結果分析：抗原或抗體是否存在；抗原或抗體的純度：若在兩孔內(nèi)有兩對或兩對以上的抗原抗體系統(tǒng)，就能產(chǎn)生相應數(shù)量的分離的沉淀線。抗原或抗體相對濃度：抗原濃度越高，形成的沉淀線距離抗原孔越遠，抗體濃度越高，形成的沉淀線距抗體孔越遠；抗原或抗體相對分子量：抗原或抗體在瓊脂內(nèi)的擴散受分子量影響，分子量大者擴散速度慢，擴散圈小，局部濃度高，因此形成的沉淀圈彎向分子量大的一方，若二者分子量相等，則沉淀線呈直線；抗原性質(zhì)：觀察兩個鄰近孔的抗原與抗體所形成的兩條線是交叉抑或相連，可用來判斷該兩抗原是否有共同成分。同樣的純抗原a放在兩個鄰近的孔中，對應抗體放在中央孔中，兩條沉淀線在其相鄰的末端會互相連接和融合；若兩個不同的抗原a和b，則兩線互相交叉；若兩個抗原有部分相同成分a和ab，則兩線除有相連部分以外還有一伸出部分。滴定抗體效價：固定抗原濃度，稀釋抗體，出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋度為該抗體的效價?？乖⒖贵w相對分子量Ag分子量大于AbAb分子量大于AgAg分子量等于Ab抗原決定簇部分相同抗原決定簇完全相同抗原性質(zhì)分析兩個抗原的抗原決定簇完全不同雙向瓊脂擴散試驗的應用1.檢測未知抗原或抗體2.抗原性質(zhì)分析3.抗體效價滴定4.抗原或抗體純度鑒定電泳條件下的沉淀反應免疫電泳是利用蛋白質(zhì)在凝膠中電泳遷移率不同能被分離的特性與免疫擴散結合進行分析的方法。原理：混合的蛋白質(zhì)抗原在ＰＨ８．６時帶負電荷，在電場的作用下，由負極向正極遷移，使混合的抗原組分得以分離?？贵w可以通過自由擴散，也可以通過電泳與分離的抗原形成相應的特異性沉淀線，從而提高免疫沉淀的靈敏度。常用的免疫方法有：血清免疫電泳、火箭電泳和對流免疫電泳血清免疫電泳將患者血清和正常人血清分別放在凝膠上近負極端的小孔中進行電泳分離后，在兩中抗原之間沿電泳方向挖一條平行的小槽，加入抗血清進行雙擴散。-+免疫電泳示意圖根據(jù)沉淀線的位置及粗細，可分析樣品中的抗原含量；根據(jù)蛋白質(zhì)的電泳遷移率，免疫特性及其它特性，可以確定該復合物中含有某種蛋白質(zhì)?；鸺娪?/p>

將單向免疫擴散和電泳相結合的一種定量檢測技術。

原理：電泳時，含于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動，而在電場的作用下促使樣品中的抗原向正極泳動。當抗原與抗體分子達到適當比例時，形成一個形狀如火箭的不溶性免疫復合物沉淀峰，峰的高度與樣本中的抗原濃度呈正相關。注意要點：選擇無電滲或電滲很小的瓊脂糖，否則火箭形狀不規(guī)則；若火箭頂部形狀呈不清晰的云霧狀，提示電泳時間不夠，未到達終點；作IgG定量時，由于瓊脂中的抗IgG抗體也是IgG，免疫反應中的抗原抗體性質(zhì)相同，由于電滲作用影響了待測IgG的泳動，火箭峰呈紡錘狀。為了抵消電滲作用，可用甲醛使樣本IgG上的氨基甲酰化，使本來帶兩性電荷的IgG只帶負電荷，加快泳動速度，出現(xiàn)伸向陽極的火箭峰?；鸺娪镜臋z測靈敏度在μg/ml水平。可采用競爭法放射自顯影技術來進行火箭免疫電泳，靈敏度可達ng/ml。對流免疫電泳在pH8.6的瓊脂凝膠中，大部分蛋白質(zhì)抗原在堿性溶液中帶負電荷，且分子較小，電泳時，泳向正極?？贵w帶弱負電荷，但分子量大，電泳力小于電滲力，泳向負極?？乖涂贵w相遇，比例合適時形成肉眼可見的沉淀線。AgAb-+1.Ag陽性2.Ag弱陽性3.Ag強陽性4.Ag強陽性對流免疫電泳示意圖免疫共沉淀在溶液中兩種或兩種以上蛋白質(zhì)相互作用，可以通過免疫共沉淀驚醒鑒定和分離。蛋白質(zhì)相互作用通過非共價結合，用針對其中一種蛋白質(zhì)的特異性抗體進行的免疫沉淀，與該蛋白相互作用的其他蛋白也同時被沉淀下來。如果第一抗體結合后再加入第二抗體或A蛋白可使抗原抗體形成更大的復合物易于沉淀，也可通過加入聚乙二醇破壞水化膜加速沉淀形成。免疫共沉淀原理圖解關鍵因素1.抗原的豐富度2.抗體的結合能力3.蛋白質(zhì)和抗體的可接觸性免疫凝集大顆粒性抗原如細胞或細菌等與相應的抗體結合后能使康媛顆粒發(fā)生凝集，形成肉眼易見的凝集小塊，即為免疫凝集。

凝集反應的發(fā)生分為兩個階段：1、抗原抗體的特異性結合階段；2、出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。最常見的免疫凝集反應是紅細胞凝集，即血凝反應。血凝反應的抗體識別的抗原可以是紅細胞表面的天然抗原，如血凝鑒定試驗；也可以通過交聯(lián)將紅細胞連接上其他抗原，如早期的HBsAg血凝試驗。細菌的血凝試驗常用來對細菌進行鑒定與分型，如沙門菌鞭毛抗原的分析等。免疫凝集試驗雖然簡便，但是受反應靈敏度的限制，在實際應用越來越少。女科學家R.Yalow（美,1921~）1950’末發(fā)明（胰島素），1977年獲諾貝爾醫(yī)學獎1.基本原理（1）競爭結合分析：Ag+AbAgAb

*Ag+Ab

*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2.常用標記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年3.測量儀器（1）γ計數(shù)儀（2）β液閃儀免疫標記一、放射免疫分析（RIA）一、放射免疫分析（RIA）基本原理采用定量的標記抗原（Ag＋）和非標記抗原（Ag）競爭性結合有限量特異性抗體（Ab）的反應。采用定量的標記抗原（Ag＋）和非標記抗原（Ag）競爭性結合有限量特異性抗體（Ab）的反應4.基本試劑（1）標準品與質(zhì)控品a.意義：放射免疫定量分析的尺度、質(zhì)量控制的依據(jù)b.要求：化學結構上——與待測物有相同的化學結構化學純度上——對競爭反應有干擾的雜質(zhì)的含量低含量準確注意不變質(zhì)與降解：在運輸、保存時尤應注意；注意有效期c.種類：國際標準、國家標準、企業(yè)標準（2）標記物a.對標記物的要求比活度高：即單位物質(zhì)的放射性強度高生物活性及免疫活性與標記前改變小

放射化學純度高：應>95%穩(wěn)定性好：標記的同位素不易脫落b.標記方法：氯胺-T法：最常用的125I標記法，I與酪氨酸共價結合，方法簡便，但易造成蛋白質(zhì)的損傷乳過氧化酶法：Iodogen（氯甘脲）法：固相法，標記率較高，損傷小，反應時間長置換法：3H最常用c.標記產(chǎn)物的純化：常用Sephadex層析，也可用硅膠G薄板層析或HPLC分離d.標記產(chǎn)物的鑒定：常用RIA法最大結合百分率標準曲線比較法e.半抗原的標記：必須先連接載體，常用牛血清白蛋白（BSA），再對載體作標記（3）特異性結合抗體a.對特異性結合抗體的要求：親和力（affinity）高：指單個抗體分子與抗原決定簇特異結合的能力，用K值表示，反映靈敏度特異性高：與待測抗原的結合力高，而與待測抗原類似物的結合能力（交叉反應）低滴度（效價）高：指結合50%標記抗原時抗體的稀釋度高穩(wěn)定性好：能長期保存，化學性質(zhì)、效價穩(wěn)定b.抗體的制備選擇合適的免疫動物：兔、鼠、羊

應用佐劑：福氏完全佐劑與不完全佐劑（羊毛脂、石蠟油+卡介苗）選擇合適的免疫方法：劑量、接種途徑（腹股溝、腋窩、脊柱兩側皮內(nèi)多點）、間隔時間（加強）與次數(shù)c.抗體的純化去除雜抗體：用抗原吸附法提取特異性IgG：先用鹽析法粗提，再用離子交換層析或親和層析純化d.抗體的鑒定鑒定內(nèi)容：效價、親和力、