園柏和龍柏?fù)]發(fā)性成分分析及其抑菌和殺菌效果比較

園柏和龍柏?fù)]發(fā)性成分分析及其抑菌和殺菌效果比較

柏樹和柏樹（蘑菇）屬于柏樹科，柏樹是柏樹的種子種。園柏和龍柏常綠，樹形優(yōu)美，歷來就是風(fēng)景園林的重要植物。園柏和龍柏樹干、枝和葉等部位氣味芳香，其揮發(fā)物成分及其對住區(qū)環(huán)境和人體健康的影響為人們關(guān)注。為此，我們測定了園柏和龍柏的揮發(fā)物組分，并對二者主要揮發(fā)物及其抑菌和殺菌效果進(jìn)行研究。1材料和方法1.1得油率的測定于2003年8月在上海植物園采集新鮮的園柏和龍柏葉片，攤放在陰涼處晾干，粉碎后裝入圓底燒瓶，約3h后，得到淺黃色有特殊氣味的揮發(fā)油，得油率分別約為0.4%和0.5%。分裝于1.5mlEppendorf管，用Parafilm膜封口，-20℃保存，以減少揮發(fā)。1.2離子火焰檢測采用FinniganMATITD800GC-MS-DS氣相色譜-質(zhì)譜儀，儀器條件：HP-5石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫60℃（2min）～250℃（10min），升溫速度10℃/min，載氣為氦氣，載氣壓力為0.25MPa；進(jìn)樣量0.1μl。MS條件：電離方式EI，電離電壓70eV，燈絲電流80μA，離子焰溫度200℃。數(shù)據(jù)處理及聯(lián)機檢索：利用氣質(zhì)聯(lián)用儀計算機的NIST-MS譜庫自動檢索各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并對機檢結(jié)果參考有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行核對和補充檢索，經(jīng)色譜峰面積歸一化法計算，得出主要組分的相對含量。1.3外部感染和細(xì)菌試驗1.3.1試驗對象的樣品園柏、龍柏?fù)]發(fā)油（使用前用無水乙醇和5‰的Tween-80水溶液乳化）。1.3.2菌株來源pseudomracd.3表皮葡萄球菌（StaphylococcusepidermidisATCC-35984），金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusATCC-29213），大腸桿菌（EscherichiacoliATCC-25922），綠膿桿菌（PseudomonasaeruginosaATCC-27853），以上標(biāo)準(zhǔn)菌株由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子病毒國家重點實驗室提供。1.3.3氨芐激素鹽析無水乙醇（上海振興化工一廠）,5‰的Tween-80水溶液（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司）:高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后4℃保存；氨芐青霉素（上海生工生物制品有限公司）貯存液（100mg/ml）:經(jīng)0.22μm微孔濾器過濾后，分裝于1.5mlEppendorf管，-20℃保存；水解酪蛋白（MH）平皿（上海市疾病預(yù)防控制中心），100ml三蒸水:121℃，103.35kPa高壓蒸汽滅菌20min，分裝于1.5ml無菌Eppendorf管，冷卻后，-20℃保存。1.3.4原水制備蒸汽冷卻MH培養(yǎng)基，MH21g溶于1000ml去離子水中，121℃，103.35kPa高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后，4℃保存。1.3.5培養(yǎng)有能力的發(fā)揮取-70℃條件下保存的保藏菌株，按1∶100接種，置于37℃培養(yǎng)過夜。細(xì)菌用比濁法記數(shù)，繼續(xù)稀釋培養(yǎng)至光密度（OD600）值=0.3，調(diào)整細(xì)菌懸液的濃度，使其含菌量為107cfu/ml，即得供試菌懸液。采用試管稀釋法。1.3.6.最低抑菌濃度的確定園柏和龍柏?fù)]發(fā)油用無水乙醇和5‰的Tween-80水溶液稀釋，振蕩器振蕩使乳化均勻。連續(xù)稀釋使其試驗濃度分別為16、12、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。陽性對照：用三蒸水連續(xù)稀釋氨芐青霉素貯存液（100mg/ml），混勻，使氨芐青霉素試驗濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml；陰性對照：5‰Tween-80水溶液和MH培養(yǎng)基。取8支無菌試管，分別標(biāo)記為a,b,c,d,e,f,g,h。每管加入850μlMH培養(yǎng)基和100μl菌懸液（107cfu/ml）。將分裝好的植物樣品揮發(fā)油分別加入相應(yīng)編號的試管，加蓋試管帽并用Parafilm膜封口。在搖床內(nèi)，37℃，220r/min培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，以完全無菌生長的揮發(fā)油最高稀釋度作為該揮發(fā)油的最低抑菌濃度。按上述同樣方法處理氨芐青霉素（區(qū)別在于每管加入836μlMH培養(yǎng)基）。另取2支無菌試管，一管加入1mlMH培養(yǎng)基，另一管加入1ml5‰Tween-80水溶液,在相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。1.3.6.殘留藥物消除法從MIC試驗無菌生長的試管中吸取10μl培養(yǎng)液加入裝有90μlMH培養(yǎng)基的無菌Eppendoff管，混和均勻（以稀釋法解除殘留藥物的抑菌作用）。將稀釋后的100μl菌液加入MH平皿，用三角玻棒涂布均勻。正面向上放入37℃的培養(yǎng)箱，約0.5h后（待表面干燥）將平皿翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)培養(yǎng)18～24h（視菌種不同而定）。以完全無菌生長的揮發(fā)油最高稀釋度作為該揮發(fā)油的最低殺菌濃度。2結(jié)果2.1揮發(fā)油中的其他化學(xué)成分結(jié)果見圖1和表1。園柏和龍柏?fù)]發(fā)油中含量最高的成分均為乙酸龍腦酯（bornylacetate），該成分在園柏和龍柏?fù)]發(fā)油中的含量分別為38.1%和46.5%。揮發(fā)油中含量次之的其他成分完全不同，園柏?fù)]發(fā)油中含24.9%的水芹烯（phellandrene）和12.4%的對薄荷-1-烯-4-醇（p-menth-l-en-4-ol）；龍柏?fù)]發(fā)油中含30.0%的檸檬烯（limonene）和7.9%的β-蒎烯（β-pinene）。2.2最低抑菌及最低殺菌濃度結(jié)果見表2。在實驗濃度下，園柏?fù)]發(fā)油對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌均有較強的抑菌及殺菌效果，最低抑菌濃度和最低殺菌濃度分別為4、8mg/L;2、8mg/L;8、8mg/L。而龍柏?fù)]發(fā)油僅對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌有抑菌作用，最低抑菌濃度分別為2、4mg/L，并且只對表皮葡萄球菌有殺菌作用，最低殺菌濃度為16mg/L。3利用乙酸龍腦酯作園林本研究結(jié)果顯示，從揮發(fā)油主要成分看,園柏和龍柏均含有乙酸龍腦酯，含量高達(dá)38.1%和46.5%，乙酸龍腦酯是醫(yī)藥及香料工業(yè)的重要原料，具有濃烈的清