醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-上課用-11.疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)

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第十一章疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)

MolecularBasisofDiseasesFormation

2基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)異常與疾病人類疾病如白血病、惡性腫瘤、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心腦血管、高血壓等的發(fā)生和發(fā)展都涉及到有關(guān)蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、功能和相互作用異常。疾病的本質(zhì)是蛋白質(zhì)功能紊亂，是各種原因引起蛋白質(zhì)質(zhì)和量的改變。3疾病產(chǎn)生的分子機(jī)制

基因結(jié)構(gòu)的改變；

受細(xì)胞調(diào)節(jié)因素或其他因素影響使基因表達(dá)方式改變；

外來的致病基因；

蛋白質(zhì)翻譯后加工及降解發(fā)生變化；第一節(jié)基因結(jié)構(gòu)改變與疾病一、基因突變二、基因突變的遺傳學(xué)效應(yīng)三、結(jié)構(gòu)基因變異導(dǎo)致的疾病四、調(diào)控序列變異導(dǎo)致基因表達(dá)水平變化5自發(fā)性復(fù)制錯誤堿基脫落或部分脫落活性氧簇（ROS）物理因素紫外線電離輻射化學(xué)因素烷化劑堿基類似物修飾劑DNADNA突變的原因病原生物基因的整合1.點(diǎn)突變是單個堿基的改變2.缺失是一個或多個核苷酸的丟失3.插入是一個或多個核苷酸的增加4.倒位是一段核苷酸序列方向倒轉(zhuǎn)5.基因突變還分為配子突變與體細(xì)胞突變6.動態(tài)突變指串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)隨世代的傳遞而改變一、基因突變的類型脆性X綜合癥強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良Huntington舞蹈病Friedreich共濟(jì)失調(diào)癥CCG拷貝數(shù)過度增加3’非翻譯區(qū)CTG拷貝數(shù)過度增加編碼區(qū)CAG拷貝數(shù)過度增加內(nèi)含子CAA拷貝數(shù)過度增加8脆性X綜合征“CCG”重復(fù)發(fā)生在FMR1（脆性X智力低下基因1）的5’非翻譯區(qū)，拷貝數(shù)不穩(wěn)定。8~50拷貝（正常人）52~200拷貝（攜帶者）200~1000拷貝（患者）9（一）遺傳密碼突變1.錯義突變（missensemutation）2.無義突變（nonsensemutation）3.同義突變（consensemutation）5.移碼突變（frame-shiftmutation)二、基因突變的遺傳效應(yīng)1.錯義突變：指DNA改變后mRNA中相應(yīng)密碼子發(fā)生改變，編碼另一種氨基酸，使蛋白質(zhì)中的氨基酸發(fā)生改變。5’---UCUCAAUUUACG---3’AAAmRNA

LysSerGlnpolypeptide5’---UCUCAAUUUACG---3’AAGGluPheThrAAA（Lys）

GAA（Glu）

有些錯義突變不影響蛋白質(zhì)的生物活性，不表現(xiàn)出明顯的表型效應(yīng)。5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG---3’AAATGC---5’AATTTA2.無義突變：基因突變導(dǎo)致mRNA密碼子變成了終止密碼子，引起多肽鏈合成的終止。DNA

5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG---3’AAATGC---5’AATTAT5’---UCUCAAUUUACG---3’AAAmRNA

LysPheThrSerGlnpolypeptide5’---UCUCAAUUUACG---3’AAUStopSerGlnAAA（Lys）

UAA（Stop）3.同義突變：基因突變導(dǎo)致mRNA密碼子改變，所編碼的氨基酸不變。DNA

5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG---3’AAAAAATGC---5’TTT5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG---3’AAGAAATGC---5’TTC5’---UCUCAAUUUACG---3’AAAmRNA

LysPheThrSerGlnpolypeptide5’---UCUCAAUUUACG---3’AAGLysPheThrSerGlnAAA

AAG（Lys）突變改變了mRNA上的密碼子讀碼框≠3xdNt移碼突變GCUGCUGCUGCUGCUCUGCUGCUGAlaAlaLeu

LeuLeu

AlaAlaAlaDeletion

=3xdNt

±nx氨基酸GCUUGCUGCAUGCAU

GCUGCUGCAAlaAlaCysCysMetAlaAlaHis4.移碼突變：單個或數(shù)個堿基的缺失或插入、基因片段的缺失或插入，導(dǎo)致突變點(diǎn)后的閱讀框發(fā)生改變，從而引起氨基酸順序的改變。14（二）基因突變影響hnRNA的剪接基因突變發(fā)生在hnRNA的一級結(jié)構(gòu)上特定的剪接位點(diǎn)上，形成新的剪接位點(diǎn)或使正常剪接位點(diǎn)消失，導(dǎo)致hnRNA的剪接錯誤，產(chǎn)生異常的mRNA，最終產(chǎn)生異常的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，改變疾病發(fā)生。15真核生物基因的剪接位點(diǎn)：由內(nèi)含子的5′端“GT”和3′端“AG”，及內(nèi)含子和外顯子內(nèi)的其它調(diào)控元件共同決定。外顯子1內(nèi)含子1外顯子2外顯子1外顯子2外顯子1內(nèi)含子1外顯子1hnRNA剪接?YesNo16例：家族性孤立性生長激素缺乏Ⅱ型遺傳病由于GH-1基因的EXONⅢ上第5nt由G→A，破壞一個ESE，使EXONⅢ被跳過，而最終造成編碼蛋白縮短，影響功能。17轉(zhuǎn)入了人缺陷型的GH-1基因利用RNAi使導(dǎo)入基因沉默2007年18三、結(jié)構(gòu)基因改變導(dǎo)致的疾病結(jié)構(gòu)基因發(fā)生改變會改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。19（一）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化引起的疾病1.血紅蛋白病(hemoglobinopathy)

是一組由于血紅蛋白遺傳缺陷引起的疾病。異常血紅蛋白病：珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)異常；地中海貧血：珠蛋白肽鏈合成障礙血紅蛋白(Hb)結(jié)構(gòu)20血紅蛋白病——鐮刀形細(xì)胞貧血癥GAGGTG2122基因突變類型異常Hb氨基酸變化臨床特征錯義突變HbShuangfengα27Glu→Lys(GAG→AAG)不穩(wěn)定Hb病HbSβ6Glu→Val(GAG→GUG)鐮刀型細(xì)胞貧血HbBibbaα136Leu→Pro(CUG→CCA)不穩(wěn)定Hb病無義突變HbMckeesRocksβ145Tyr→終止(UAU→UAA)不穩(wěn)定Hb病終止密碼突變HbConstantSpringα142UAA→CAA(延長：142Gln---173)α-地貧血紅蛋白病分子基礎(chǔ)23基因突變類型異常Hb氨基酸變化臨床特征密碼子缺失HbGunHillβ91～95缺失不穩(wěn)定Hb病密碼子插入HbGradyα118與119間插入3個氨基酸無明顯癥狀移碼突變HbTakβ147UAA→ACUAA延長：Thr---158UAA不穩(wěn)定Hb病融合突變HbLepore-Bostonδ87(Gln)-β116(His)β-地貧HbKenyaγ81(Leu)-β86(Ala)β-地貧血紅蛋白病分子基礎(chǔ)242.家族性高膽固醇血癥

一種常染色體顯性遺傳疾病，特征為低密度脂蛋白(LDL)-膽固醇水平明顯升高，可出現(xiàn)黃色瘤和動脈硬化癥。

病因：LDL受體基因變異，肝臟表面特異性的LDL-受體數(shù)目減少或缺乏，導(dǎo)致肝臟對血循環(huán)中LDL-膽固醇的清除能力下降，進(jìn)而引起血循環(huán)中LDL-膽固醇水平升高。2526（二）蛋白質(zhì)合成量變化引起的疾病27人珠蛋白基因簇及珠蛋白基因結(jié)構(gòu)28

珠蛋白基因的表達(dá)在時空上受到遺傳因素的精確調(diào)控，表現(xiàn)為以下特點(diǎn)：組織特異性發(fā)育階段特異性協(xié)同性291.α-地貧基因缺失類型α1α2正?；菊＆力力力?輕度貧血α+α+輕度貧血αα0高度貧血α+α0HbBart’s綜合征α0α0302.β-地貧類型β珠蛋白基因第17位密碼子AAG(Lys)→TAG,發(fā)生無義突變,引起β0地貧;β珠蛋白基因的編碼順序內(nèi)插入或缺失1、２、４或７個核苷酸，移碼突變，造成β-珠蛋白肽鏈合成提前終止，而引起β0地貧。31四、調(diào)控序列變異導(dǎo)致基因表達(dá)水平變化

順式作用元件的基因突變，會降低β珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，使β珠蛋白合成減少，引起β+-地貧。TATA盒：-32（C→A)、-30(T→C)、-29(A→G)、-28(A→G)。CAAT盒：-101、-92、-88、-87、-86等位點(diǎn)的點(diǎn)突變。CAATTATACAPPolyA尾130311041051465′3′IVSⅠIVSⅡIS（一）β珠蛋白基因啟動子突變32啟動子和外顯子1之間大于10kb的缺失;另一種是啟動子和外顯子1之間大于6kb的缺失。兩種突變都使LDL受體基因的表達(dá)能力完全喪失。（二）LDL受體啟動子變異33一些內(nèi)含子的變異也會影響蛋白質(zhì)的合成，使體內(nèi)相應(yīng)蛋白質(zhì)含量減少或缺失。ApoB100基因內(nèi)含子的第一個堿基會發(fā)生G→T突變，突變基因轉(zhuǎn)錄后生產(chǎn)的hnRNA，會影響ApoB100mRNA的正常剪切。34第二節(jié)細(xì)胞間異常信號導(dǎo)致基因

表達(dá)異常引起疾病

人體各細(xì)胞間通過激素、神經(jīng)遞質(zhì)、旁分泌信號等保持細(xì)胞間的聯(lián)系，調(diào)節(jié)彼此的代謝?；虮磉_(dá)也受到細(xì)胞間信號的調(diào)控。35甲胎蛋白(AFP)接受異常細(xì)胞增殖信號成為肝癌發(fā)生的重要因素。胚胎發(fā)育過程中，AFP增強(qiáng)子激活;出生后，AFP沉默子處于活化狀態(tài)。異常細(xì)胞增殖信號的作用下,c-myc、c-fos、c-jun等癌基因表達(dá)異常增加，其表達(dá)產(chǎn)物與AFP基因順式作用元件結(jié)合，激活A(yù)FP基因表達(dá)。AFP與細(xì)胞膜受體結(jié)合，影響TNF及其受體表達(dá)，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，并促進(jìn)其生長。36粉塵刺激→肺支氣管上皮、肺泡巨噬細(xì)胞→分泌TGF-β1→刺激成纖維細(xì)胞→促細(xì)胞分裂和ECM蛋白基因表達(dá)→ECM蛋白合成和分泌增加（各型膠原蛋白、IL-1、TNF等）→ECM病理性蓄積，矽肺發(fā)生塵肺：長期吸入大量含游離二氧化硅粉塵引起的以肺纖維化為主要病變的疾病37第三節(jié)細(xì)胞內(nèi)因素導(dǎo)致基因

表達(dá)異常引起疾病異常的細(xì)胞內(nèi)信號持續(xù)高血糖引起的糖尿病心肌病高血糖→DAG↑→⊕PKC激活→⊕ACE活化→AngⅡ↑→心肌重塑、心肌肥大。38

異常的DNA甲基化hCG5′轉(zhuǎn)錄起始區(qū)低甲基化→非滋養(yǎng)層細(xì)胞hCG↑→與受體結(jié)合→⊕激活cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑→惡性腫瘤發(fā)生↑39ProteinscomplexedwithDNAallowformore“open”structure;canbetranscribed….Methylationleadstochangeinchromatinstructure;morecondensedstateistranscriptionallyinactive…genesare“off”

…40人絨毛膜促性腺激素(hCG)在妊娠早期維持黃體功能、促進(jìn)妊娠進(jìn)行和胎兒性別分化等；腫瘤細(xì)胞中，hCG基因5’轉(zhuǎn)錄起始區(qū)發(fā)生去甲基化或低甲基化，形成非滋養(yǎng)層細(xì)胞中異位表達(dá)，具有類似與生長因子作用，激活cAMP旁路信號途徑，獨(dú)立地調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化和生長。41第四節(jié)翻譯后加工運(yùn)輸障礙與疾病白化病Albinism42酪氨酸酶與Ⅰ型泛素性白化病酪氨酸酶催化結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變可以使酪氨酸酶的活性降低甚至消失，黑色素合成減少或不能合成，導(dǎo)致Ⅰ型泛素性白化病;酪氨酸酶催化結(jié)構(gòu)域以外的點(diǎn)突變導(dǎo)致色素缺失，蛋白質(zhì)不能正確折疊，不能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出而滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，無法完成其成熟及運(yùn)輸過程。43蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)異常酪氨酸酶P蛋白高爾基體黑色素體P蛋白基因突變黑色素合成障礙引起Ⅱ型泛發(fā)性白化病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酪氨酸酶與Ⅰ型泛素性白化病44第五節(jié)

蛋白質(zhì)降解異常與疾病蛋白質(zhì)降解途徑溶酶體：降解細(xì)胞吞入的胞外蛋白質(zhì)泛素-蛋白酶體：降解胞內(nèi)泛素化的蛋白質(zhì)泛素(ubiquitin,Ub)E1(泛素激活酶)E2(泛素結(jié)合酶),E3(泛素連接酶)26S蛋白酶體(proteasome)

45泛素-蛋白酶體途徑46泛素-蛋白酶體系統(tǒng)活性被異常抑制或激活均可導(dǎo)致機(jī)體紊亂。2004年諾貝爾化學(xué)獎阿龍·切哈諾沃(Aaron

Ciechanover)阿夫拉姆·赫什科(Avram

Hershko)歐文·羅斯(Irwin

Rose)47（一）高血脂：載脂蛋白的過度降解載脂蛋白（apolipoprotein,apo)：與脂質(zhì)結(jié)合的運(yùn)輸載體泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在維持正常載脂蛋白含量中起到重要的作用，該系統(tǒng)功能障礙，會導(dǎo)致載脂蛋白含量異常。ApoAⅠ,ApoB100,ApoE,etc.48（二）阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)抑制蛋白酶體活性

中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的疾病。表現(xiàn)為近期記憶力降低，繼而表現(xiàn)持續(xù)性智能衰退、失語、判斷推理能力喪失，以及運(yùn)動障礙等。AD最顯著的神經(jīng)病理組織學(xué)特征是老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，β-淀粉樣蛋白在老年斑的形成過程中起十分重要的作用。49第六節(jié)病原微生物基因引起的疾病感染引起機(jī)械或生物學(xué)損傷；爭奪營養(yǎng)造成營養(yǎng)缺乏；毒素引起細(xì)胞代謝功能異常；基因整合到宿主基因組，造成基因結(jié)構(gòu)改變和表達(dá)異常。5051第七節(jié)基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)與疾病的研究策略1.通過基因結(jié)構(gòu)分析確定基因變異3.通過功能學(xué)研究確定致病基因轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、反義技術(shù)、基因誘導(dǎo)超表達(dá)2.基因表達(dá)水平分析差異顯示、抑制消減雜交、基因表達(dá)系列分析52測序：雙脫氧自動化序列分析SSCP：單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析RFLP：限制性酶切長度多態(tài)性DNA芯片AS-PCR:等位特異性PCRASO雜交：寡核苷酸斑點(diǎn)雜交MS-PCR：甲基化PCRDGGEetc.一、基因結(jié)構(gòu)分析53

基本原理:在一定條件下，異源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中錯配堿基可被核糖核酸酶RNase識別并切割，通過凝膠電泳分析酶切片段的大小，即可確定錯配的位置。1.核糖核酸酶切分析（RNasecleavage）54GCATACGTAT野生型5′3′3′5′突變型GCTTACGAAT3′3′5′5′異源雜合雙鏈酶切GCAUACGTAT3′5′3′5′3′5′3′5′GCAUACGAAT？體外合成RNA探針GCAUA5′3′野生型探針155GCATACGTAT野生型5′3′3′5′突變型GCTTACGAAT3′3′5′5′異源雜合雙鏈酶切TATGCATACG3′5′3′5′3′5′3′5′TATGCATTCG體外合成RNA探針TATGC5′3′野生型探針256未發(fā)生酶切發(fā)生酶切電泳分離57缺點(diǎn)：當(dāng)RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；分析DNA的一條鏈，突變檢出率為30%；同時分析DNA的兩條鏈，突變檢出率為70%；需要制備特異性的RNA探針58

2.雜合雙鏈分析法

（heteroduplexanalysis,HA）

直接在非變性凝膠上分離雜交的突變型-野生型DNA雙鏈。由于突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成單鏈環(huán)形突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應(yīng)同源雙鏈DNA不同的遷移率。59雜合雙鏈分析（heteroduplexes

analysis）非變性膠電泳5′5′GCTACGAT缺失突變型GCATACGTAT野生型5′3′3′5′3′3′野生型DNA探針與野生型DNA雜交GCATACGTATTATGCATACG5′5′3′3′5′5′3′3′形成異源雜合雙鏈野生型DNA探針與缺失型DNA雜交TATGCATCGCGATGCATA5′3′3′5′5′3′3′5′60缺點(diǎn)：只適合200～300bp的片段;不能確定突變的具體位置;檢出率一般只有80%左右。61

3.化學(xué)切割錯配法

（Chemicalcleavageofmismatch,CCM）基本原理：將待測含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或RNA片段混合后，變性處理，進(jìn)行雜交。在異源雜合的雙鏈核酸分子中：錯配的C能被羥胺和哌啶切割，錯配的T能被四氧化鋨切割，變性凝膠電泳可確定是否存在突變。

62特點(diǎn)：突變檢出率高；如使用熒光檢測系統(tǒng)，靈敏度較高；可檢測長度達(dá)2Kb的核酸片段；步驟多、費(fèi)時、有毒；634.酶促切割錯配(enzymemismatchcleavage)酶：T4內(nèi)切核酸酶VII識別的序列：DNA:DNA異源雜合分子優(yōu)點(diǎn)：最長檢測片段可達(dá)1.5kb，省去體外合成RNA探針的步驟缺點(diǎn)：會產(chǎn)生非特異性切割，對錯配位點(diǎn)的識別也不是100%64二、基因表達(dá)水平分析Northern雜交定量RT-PCR基因表達(dá)芯片差異顯示技術(shù)抑制性消減雜交基因表達(dá)系列分析651.差異顯示技術(shù)(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)

在不同的生長時期、在個體發(fā)育與分化不同階段、在生物體對疾病的反應(yīng)以及不同環(huán)境下調(diào)控基因的表達(dá)是不同的，這就是基因的差異表達(dá)（differentialexpression）。原理：利用兩組特殊引物對差別表達(dá)的基因進(jìn)行擴(kuò)增。663′端引物：利用mRNA的polyA尾巴設(shè)計(jì)。根據(jù)mRNA結(jié)構(gòu)分析知道，polyA尾巴之前的兩個堿基只有12種可能的排列組合：

5′-AGAAAAA…AA-3′5′-CGAAAAA…AA-3′5′-GGAAAAA…AA-3′5′-TGAAAAA…AA-3′5′-ATAAAAA…AA-3′5′-CTAAAAA…AA-3′

5′-GTAAAAA…AA-3′5′-TTAAAAA…AA-3′5′-ACAAAAA…AA-3′5′-CCAAAAA…AA-3′5′-GCAAAAA…AA-3′5′-TCAAAAA…AA-3′67

這些引物由11～12個T及兩個其它的堿基組成，用通式5′-T11MN或5′-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱錨定引物。68

為10個堿基隨機(jī)排列組成的隨機(jī)引物。為了能對更多的基因進(jìn)行分析，應(yīng)使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5′隨機(jī)引物。5′端引物695′

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3′Poly(A)RNA5′T12MN3′錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5′

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3′3′MNTTTTTTTTTTTT5′變性5′

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3′3′MNTTTTTTTTTTTT5′退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機(jī)引物3′MNTTTTTTTTTTTT5′延長dNTP、Taq聚合酶3′MNTTTTTTTTTTTT5′5′M’N’AAAAAAAAAAA3′變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動cDNA第一鏈合成不同長度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴(kuò)增，克隆測序，同源比對隨機(jī)結(jié)合到cDNA鏈上70差異顯示技術(shù)特點(diǎn)簡單易行快速實(shí)驗(yàn)樣品需要量低多能性對低豐度mRNA的富集效率低、假陽性712.抑制性差減雜交(SSH)---DiatchenkoL,etal.PNAS1996;93:6025-6030Suppressionsubtractivehybridization:amethodforgeneratingdifferentiallyregulatedortissue-specificcDNAprobesandlibraries72原理

a.SSH是差減雜交與PCR結(jié)合的快速分離差異基因的方法。運(yùn)用雜交動力學(xué)原理，豐度高的單鏈DNA退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈DNA，使不同豐度的單鏈DNA得到均衡；

b.抑制PCR利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點(diǎn)，使非目的基因片段兩端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu),無法作為模板與引物配對，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增，從而使目的基因得到富集、分離。73方法提取實(shí)驗(yàn)組和對照組mRNA合成雙鏈cDNA，經(jīng)識別4堿基的限制性內(nèi)切酶RsaⅠ切割實(shí)驗(yàn)組cDNA平均分為2份，分別連接2個接頭進(jìn)行2輪差減雜交和PCR獲得富集的目的基因74檢測組(Tester)—

含目的基因cDNA，加接頭驅(qū)逐組(Driver)—

不含目的基因cDNA，不加接頭*接頭含PCR引物正向SSH:易感者(Tester)+不易感者(Driver)易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因反向SSH:不易感者(Tester)+易感者(Driver)不易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因

75抑制性差減雜交(SSH)

流程圖76優(yōu)點(diǎn)采用兩次差減雜交和PCR，保證了高特異性(假陽性率可降至6％);在雜交過程中可使不同豐度基因均衡化，獲得低豐度差異表達(dá)基因;操作相對簡便，是目前分離新基因的主要方法。缺點(diǎn)起始材料需要

g級量mRNA;SSH差減克隆片段較小，獲取cDNA全長序列有一定難度。77ElkelesA,etal.MolCellBiol

，1999;19:2594-2600Thec-fosproto-oncogeneisatargetfortransactivationbythep53tumorsuppressor采用SSH法證實(shí),在p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，c-fos是p53轉(zhuǎn)錄刺激的靶基因,從而提供了這兩種重要調(diào)控蛋白相互作用的直接依據(jù)。抑制性差減雜交(SSH)78KosticCandShawPH.Oncogene，2000;19:3978-3987Isolationandcharacterizationofsixteennovelp53responsegenes

通過SSH比較了p53缺失和含p53的結(jié)腸癌細(xì)胞株間基因差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)16個p53依賴的下游靶基因。抑制性差減雜交(SSH)793.基因表達(dá)系列分析

(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)

是一種用于定量、高通量基因表達(dá)分析的實(shí)驗(yàn)方法(Velculescuetal.,1995)。SAGE原理:分離每個轉(zhuǎn)錄本特定位置的較短單一的序列標(biāo)簽（約9-11個堿基對），這些短的序列被連接、克隆和測序，特定的序列標(biāo)簽的出現(xiàn)次數(shù)就反應(yīng)了對應(yīng)基因的表達(dá)豐度。80Serialanalysisofgeneexpression(SAGE)技術(shù)流程反轉(zhuǎn)錄酶切連接測序單條測序＝＝對30－40條EST測序分析由于采樣量大大提高，可對低表達(dá)基因進(jìn)行分析：基因表達(dá)量分析、尋找新基因等等實(shí)驗(yàn)步驟較長要求較高81三、基因功能的研究轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因打靶反義寡核苷酸技術(shù)反義RNA技術(shù)核酶技術(shù)RNA干擾技術(shù)基因誘導(dǎo)超表達(dá)技術(shù)反義技術(shù)821.轉(zhuǎn)基因技術(shù)

指在生物基因組中帶有插入或整合的外源基因，生物個體能將它傳給后代，并表達(dá)出該基因的生物活性物質(zhì)，從而使受體生物獲得新的性狀。83

采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體。

轉(zhuǎn)基因——

被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)——

目的基因的受體動物84基本方法顯微注射法胚胎干細(xì)胞法(embryonicstemcells,ES細(xì)胞)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法轉(zhuǎn)基因動物中外源基因的檢測染色體及基因水平：斑點(diǎn)雜交、Southern雜交、PCR轉(zhuǎn)錄水平：Northern雜交蛋白質(zhì)水平：Western印跡85轉(zhuǎn)基因動物操作技術(shù)流程

獲取外源目的基因含有外源目的基因的重組載體導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇攜帶目的基因的細(xì)胞，選擇體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物簡明操作步驟86

轉(zhuǎn)基因動物實(shí)例一超級奶牛－普通奶牛的三倍大（英國）87轉(zhuǎn)基因動物實(shí)例二東北農(nóng)業(yè)大學(xué)－國內(nèi)首例綠色熒光蛋白“轉(zhuǎn)基因”克隆豬綠色熒光蛋白－豬胎兒成纖維細(xì)胞－克隆

88轉(zhuǎn)基因動物實(shí)例三轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白的兔89轉(zhuǎn)基因動物實(shí)例四正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因山羊的實(shí)驗(yàn)

乳汁中分泌人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所902.基因打靶(genetargeting)通過DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究該基因的功能。基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代91MarrioCapecchi于八十年代末在Utah大學(xué)發(fā)展起來。實(shí)驗(yàn)動物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就稱為敲除小鼠(knockoutmice)。基因敲除技術(shù)是研究基因功能的一項(xiàng)非常有用的技術(shù)(遺傳病研究、研究特定基因的細(xì)胞生物學(xué)活性以及研究發(fā)育調(diào)控的基因作用）?；蚯贸且惶捉M合技術(shù)，包括基因重組、細(xì)胞分離培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因等。92基因打靶的必備條件胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標(biāo)志HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)93基因敲除的基本程序打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種9495美國猶他大學(xué)MarioR.Capecchi美國北卡羅來納州大學(xué)Oliver

Smithies英國卡迪夫大學(xué)MartinJ.Evans2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎:基因打靶963.反義技術(shù)97

核酶技術(shù)確定基因在疾病中的作用（1）RNA分子，催化核糖體RNA中內(nèi)含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，還可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA鏈的復(fù)制等。（2）優(yōu)點(diǎn):其底物的堿基配對特異性。核酶與底物結(jié)合常形成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)或“錘頭”結(jié)構(gòu)。（3）設(shè)計(jì)核酶特異性地結(jié)合于靶點(diǎn)，以其本身酶活性進(jìn)行剪切。98核酶的作用機(jī)制

99

與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。

100

反義RNA技術(shù)

antisenseRNA

自身沒有編碼功能，但能與目標(biāo)RNA特別是mRNA的特定區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的一類RNA;自然存在，或人工生物合成。101反義寡核苷酸技術(shù)

(antisenseoligonucleotide,ASON)

人工合成的能與目的DNA或RNA互補(bǔ)的寡核苷酸（15-20nt）。肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)

核酸分子中的磷酸二酯鍵骨架被酰胺鍵骨架取代，具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性。1024.RNA干擾（RNAinterference，RNAi）內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象。103共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

ＲＮＡｉ研究的早期線索早在20年前,來自于美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組RichJorgensen和同事,在對矮牽牛(petunias)進(jìn)行的研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn):將一個能產(chǎn)生色素的基因置于一個強(qiáng)啟動子后,導(dǎo)入矮腳牽牛中,試圖加深花朵的紫顏色,結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵,多數(shù)花成了花斑的甚至白的。Jorgensen將這種現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression),因?yàn)閷?dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時都被抑制。開始這被認(rèn)為是矮牽牛特有的怪現(xiàn)象,后來發(fā)現(xiàn)在其他許多植物中,甚至在真菌中也有類似的現(xiàn)象。

104105RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)線蟲（C.elegans)1995年康乃爾大學(xué)的研究人員Guo和Kemphues+Par-1GeneDisruptionExpressionDownDoubleStrandRNA線蟲，果蠅微生物，植物

106

1998年被解開———華盛頓卡耐基研究院的AndrewFire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的CraigMello首次使用雙鏈dsRNA高效地特異性阻斷同源基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明在線蟲中注入雙鏈ＲＮＡ不單可以阻斷整個線蟲的同源基因表達(dá),還會導(dǎo)致其第一代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱為ＲＮＡ干擾。107dsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表達(dá)的機(jī)理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNA1085.基因誘導(dǎo)超表達(dá)技術(shù)

將目的基因全長序列與高活性啟動子或組織特異性啟動子融合，經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，在誘導(dǎo)劑的作用下或在特定的組織細(xì)胞中，目的基因超表達(dá)，相應(yīng)的基因表達(dá)產(chǎn)物大量積累。比較加入誘導(dǎo)劑前后的表型變化，從而確定目的基因在疾病發(fā)生中的作用。109Thankyou110附1、疾病相關(guān)基因的功能克隆和定位克隆1．疾病相關(guān)基因2．功能克隆3．定位克隆1111、疾病相關(guān)基因與疾病單基因病(一個基因位點(diǎn)上的缺陷)多基因病(涉及兩個以上的基因位點(diǎn))染色體病(染色體結(jié)構(gòu)與數(shù)目的改變)獲得性基因病(遺傳易感性或病原微生物)112２、功能克隆(Functionalcloning)

以獲得的蛋白質(zhì)表達(dá)及功能信息為線索，分離鑒定出相應(yīng)的基因，叫未知基因的功能克隆。113

功能克?。?/p>

functionalcloning）---根據(jù)特異蛋白質(zhì)分離目的基因的策略表型克?。╬henotypecloning）---根據(jù)特異mRNA分離目的基因的策略114

氨基酸序列核苷酸序列PCR特異蛋白質(zhì)

目的基因

抗體基因文庫篩選評價優(yōu)點(diǎn)--

在單基因性狀的基因分離方面仍為常用策略缺點(diǎn)--

特異蛋白質(zhì)確定、鑒定及其純化困難*

--難以分離微量表達(dá)基因

--無法研究無蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因

--難以進(jìn)行多基因控制性狀的基因分離115通過蛋白質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)分離鑒定未知基因

基因轉(zhuǎn)錄后在核糖體上翻譯合成蛋白質(zhì)，形成核糖體-mRNA-蛋白質(zhì)產(chǎn)物部分氨基酸序列的復(fù)合體，運(yùn)用抗體與蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫共沉淀反應(yīng)，可以分離此復(fù)合體，進(jìn)而分離到mRNA，最終克隆到未知基因。116西紅柿女孩

一女孩患苯丙酮尿癥，不食“人間煙火”，僅能吃西紅柿。智力發(fā)育不全、嚴(yán)重的嘔吐，皮膚、毛發(fā)顏色變淺，虹膜顏色減退、尿、汗有特殊腐臭。目前以低苯丙氨酸飲食治療。117３、定位克隆又稱為“逆向遺傳學(xué)”，始于20世紀(jì)80年代后期利用遺傳連鎖或細(xì)胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置。克?。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進(jìn)一步研究其功能。疾病遺傳標(biāo)記，染色體定位基因序列mRNAcDNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物生物學(xué)功能

疾病

基因功能118定位克隆：通過遺傳標(biāo)記，先獲得某一表型基因在染色體上的定位，再在候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基因，進(jìn)行致病突變的篩選，