免疫學實驗凝集試驗

實驗一凝集試驗顆粒性抗原(細菌、螺旋體、紅細胞等)與相應抗體結合后，在有適量電解質存在下，抗原顆?？上嗷ツ扇庋劭梢姷哪瘔K，稱為凝集反應(Agglutinationreaction)或凝集試驗。參與凝集反應的抗原稱為凝集原（Agglutinogen），抗體稱為凝集素（Agglutinin）。細菌或其它凝集原都帶有相同的負電荷，在懸液中相互排斥而呈現(xiàn)均勻的分散狀態(tài)?？乖c相應抗體相遇后可以發(fā)生特異性結合，形成抗原抗體復合物，降低了抗原分子間的靜電排斥力，此時已有凝集的趨向，在電解質（如生理鹽水）參與下，由于離子的作用，中和了抗原抗體復合物外面的大部分電荷，使之失去了彼此間的靜電排斥力，分子間相互吸引，凝集成大的絮片或顆粒，出現(xiàn)了肉眼可見的凝集反應。根據(jù)是否出現(xiàn)凝集反應及其程度，對待測抗原或待測抗體進行定性、定量測定。凝集反應包括直接凝集反應和間接凝集反應兩大類，本實驗主要介紹直接凝集反應。[目的要求]1.掌握平板凝集試驗和試管凝集試驗的操作方法。2.掌握凝集試驗的結果判定及判定標準。3.熟悉平板凝集試驗和試管凝集試驗所需材料和試劑。[材料與試劑]1.玻板，載玻片，試管（1cmx8cm），試管架，刻度吸管，滴管，微量可調加樣器，滴頭（tip頭），牙簽或火柴棒，記號筆。2.滅菌的生理鹽水，滅菌的0.5%石炭酸生理鹽水。3.布氏桿菌病試管凝集抗原，布氏桿菌病平板凝集抗原，布氏桿菌病虎紅平板凝集抗原，布氏桿菌病陽性血清，布氏桿菌病陰性血清，被檢血清（牛、羊或豬）。4.雞白痢平板凝集抗原，雞白痢陽性血清，雞白痢陰性血清，被檢雞血清。[實驗內(nèi)容及操作方法]（一）試管凝集試驗以牛布氏桿菌病試管凝集試驗為例。1.試管準備：每份血清用試管4支，另取3支試管作為對照，作好標記，置試＋＋＋：有明顯凝集塊，液體幾乎完全透明，即75%凝集。＋＋：有可見凝集塊，液體不甚透明，即50%凝集。＋：液體混濁，有小的顆粒狀物，即25%凝集。－：液體均勻混濁，無凝集現(xiàn)象。6.平板凝集試驗與試管凝集試驗的關系見表1-2。表1-2平板凝集試驗與試管凝集試驗的關系平板凝集80402010相當于試管凝集1:251:501:1001:2007.判定標準：同試管凝集試驗。8.注意：對于陽性及可疑的被檢血清需用試管凝集試驗進行驗證。（三）虎紅平板凝集試驗這種試驗是快速平板凝集試驗?？乖遣际蠗U菌加虎紅制成?；⒓t平板凝集試驗可與試管凝集試驗及補體結合試驗效果相比，具有操作簡單、快速、特異性強的優(yōu)點。1.被檢血清和布氏桿菌病虎紅平板凝集抗原各30L滴于玻璃板的方格內(nèi)，每份血清各用一支牙簽或火柴棒混合均勻。在室溫（202.結果判定：在陽性血清及陰性血清試驗結果正確的前提下，被檢血清出現(xiàn)任何程度的凝集現(xiàn)象均判為陽性，完全不凝集的判為陰性，無可疑反應。3.注意：抗原用前充分搖勻，抗原和被檢血清用前應放室溫30-60min后再進行試驗。（四）雞白痢平板凝集試驗1.被檢雞血清和雞白痢平板凝集抗原各1滴（約302.結果判定：在室溫（20℃[思考題]1.凝集反應的原理是什么?2.哪些因素影響細菌凝集試驗?3.凝集試驗中為什么要設陽性、陰性血清及抗原對照？

實驗二病毒的血凝及血凝抑制試驗有些病毒具有凝集某種(些)動物紅細胞的能力，稱為病毒的血凝，利用這種特性設計的試驗稱血球凝集(HA)試驗，以此來推測被檢材料中有無病毒存在，是非特異性的，但病毒的凝集紅細胞的能力可被相應的特異性抗體所抑制，即血球凝集抑制(HI)試驗，具有特異性。通過HA-HI試驗，可用已知血清來鑒定未知病毒，也可用已知病毒來檢查被檢血清中的相應抗體和滴定抗體的含量。[目的要求]掌握病毒HA和HI試驗的原理和基本操作方法，了解其實用價值。[材料與試劑]1.96孔“U”形或“V”形微量反應板，50L2.生理鹽水，0.5%雞紅細胞懸液。3.新城疫病毒液（尿囊液或凍干疫苗液），新城疫陽性血清，被檢雞血清。[實驗內(nèi)容及操作方法]（一）血球凝集(HA)試驗1.在96孔微量反應板上進行，自左至右各孔加502.于左側第1孔加50L病毒液（尿囊液或凍干疫苗液），混合均勻后，吸50L至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄503.自右至左依次向各孔加入0.5%雞紅細胞懸液50表4-1病毒血凝試驗的操作方法（單位：L）孔號123456789101112病毒稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048對照生理鹽水505050505050505050505050病毒液50505050505050505050500.5%紅細胞505050505050505050505050棄50結果觀察+++++++++++++++++++++++++++++++++--4.結果判定：從靜置后10min開始觀察結果，待對照孔紅細胞已沉淀即可進行結果觀察。紅細胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100%凝集（++++），不凝集者（-）紅細胞沉于孔底呈點狀。以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為一個凝集單位。從表4-1看出，該新城疫病毒液的血凝價為1:128，則l:128為1個血凝單位，1:64、l:32分別為2、4個血凝單位，或將128/4=32，即1:32稀釋的病毒液為4個血凝單位。(二)血球凝集抑制(HI)試驗1.根據(jù)HA試驗結果，確定病毒的血凝價，配制出4個血凝單位的病毒液。2.在96孔微量反應板上進行，用固定病毒稀釋血清的方法，自第1孔至第11孔各加503.第１孔加被檢雞血清50L，吹吸混合均勻，吸50L至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50L，稀釋度分別為：1:２、1:4、1:8……4.自第1孔至12孔各加505.自第l孔至12孔各加0.5%雞紅細胞懸液50表4-2病毒血凝抑制試驗的操作方法（單位：L）孔號123456789101112血清稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒對照血清對照生理鹽水5050505050505050505050被檢雞血清50505050505050505050504單位病毒505050505050505050505050室溫中靜置10min505050505050505050505050棄去50結果觀察------++++++++++++++-6.結果判定：待病毒對照孔（第11孔）出現(xiàn)紅細胞100%凝集（++++），而血清對照孔（第12孔）為完全不凝集（-）時，即可進行結果觀察。以100％抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價，即HI效價。凡被已知新城疫陽性血清抑制血凝者，該病毒為新城疫病毒。從表4-2看出，該血清的HI效價為1:64，用以2為底的負對數(shù)(-log2)表示，即6log2。附錄1.阿氏液（Alsever）：即紅細胞保養(yǎng)液枸櫞酸鈉（5H2O）0.80g枸櫞酸（H2O）0.055g葡萄糖2.05g氯化鈉0.42g雙蒸水加至100ml將以上試劑加熱溶解于雙蒸水中，調整pH至6.8，115℃滅菌10min,42.0.5%雞紅細胞制備方法先用滅菌注射器吸取3.8%枸櫞酸鈉溶液(其量為所需血量的1／5)，從雞翅靜脈或心臟采血至需要血量，置滅菌離心管內(nèi)，加滅菌生理鹽水為抗凝血的2倍，以2000r/min離心10min，棄上清液，再加生理鹽水懸浮血球，同上法離心沉淀，如此將紅細