臨床免疫學實驗：4.5 ELISA法檢測血清抗結(jié)核抗體

免疫標記技術(shù)定義：

將抗原-抗體反應與標記技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標記的已知抗體或抗原，通過檢測標記物，間接測定未知的抗原或抗體。分類：放射免疫測定法：131I，32P免疫熒光技術(shù)：FITC，PE免疫酶測定法：HRP，AP

用標記物標記抗體或抗原進行抗原抗體反應借以提高免疫學診斷的敏感性熒光素：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）、藻紅蛋白、羅丹明（紅色熒光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶免疫熒光檢測法（IFA）放射免疫檢測法（RIA）酶免疫檢測法（EIA）免疫標記技術(shù)液相（ELISA）、固相（免疫組化技術(shù)）酶免疫測定法

(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標記的抗原或抗體進行的抗原抗體反應。

辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點：高度特異性：保持抗原抗體反應的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，可定性定量檢測：反應液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細胞表面的抗原。酶聯(lián)免疫吸附試驗

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶標記抗原或抗體檢測液體（血液、細胞液）中未知抗體或抗原的方法。1.定義2.分類直接法（directELISA）：間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標記二抗檢測液相中未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：競爭法（CompetitiveELISA)：

將特異性抗原與固相載體相連,加入合適的抗體（待測標本）,使之與抗原結(jié)合,漂洗時不被沖走。結(jié)合的抗體用酶標抗人IgG進行檢測。ELISA間接法--主要用于檢測抗體間接ELISA原理（以間接ELISA為例）：顯色1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結(jié)合3、加酶標抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+實驗步驟：顯色封閉包被Ag洗滌加待測血清Ab洗滌加酶標抗抗體洗滌終止酶標儀測OD值(在492nm波長下)固相聚苯乙烯Ag或Ab吸附到固相上的過程,稱為包被

常用酶及其底物常用底物：鄰苯二胺(OPD)：反應顯黃色，應避光，致癌性。終止后顯棕黃色四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：反應后呈藍色，無需避光，無致癌性,但水溶性差。終止后顯黃色常用底物：對硝基苯磷酸酯(p-NPP)：產(chǎn)物為黃色。AP靈敏性高于HRP，但不易獲得純品，且穩(wěn)定性低于HRP、價高，故應用不如HRP普及。1.辣根過氧化物酶(HRP)2.堿性磷酸酶(AP)HRP的底物系統(tǒng)

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP鄰苯二胺(OPD),反應中作為供氫體H2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高

有色產(chǎn)物供氫體受氫體OPD反應后顯黃色，加濃硫酸終止反應后呈棕黃色

HRP的常見底物：OPD

酶和酶作用底物酶標儀實驗內(nèi)容：

ELISA間接法測定抗結(jié)核抗體實驗材料PPD(結(jié)核桿菌蛋白衍生物)——

抗原抗結(jié)核抗體——

待測抗體（待測血清）HRP標記羊抗人IgG——

二抗包被緩沖液：0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液CB：配制100mlNa2CO30.16克，NaHCO30.29克，加雙蒸水至100ml洗滌液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS:配制1500mlNaH2PO4.2H2O0.45克，Na2HPO4.12H2O4.35克，NaCl11.4克，加雙蒸水至1500ml底物緩沖液：pH5.0磷酸鹽—檸檬酸緩沖液:配制50mlNa2HPO4.12H2O1.85克，檸檬酸0.51克加雙蒸水至50ml底物：OPD20mg，底物緩沖液50ml，30%H2O2100μL:臨用時配實驗方法1.抗原的處理：PPD凍干粉劑用包被緩沖液稀釋至10μg/ml2.包被抗原：取酶標板，加入抗原稀釋液：100μL/孔（10μg/ml）4℃，濕盒內(nèi)，過夜取出包被好抗原的酶標板，甩干孔內(nèi)液體注滿洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，1min/次3.加待測血清標記各孔，加入相應血清100μL/孔123待測2待測1待測34.加酶標二抗：37℃，濕盒內(nèi)，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，1min/次各孔加入酶標二抗100μL/孔37℃，濕盒內(nèi)，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，1min/次加入新鮮配制底物100μL/孔室溫2min,顯色后各孔加100μL/孔